Name: agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00
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Somos gratos aos Drs.. Dinesh Kumar-SP e Yule Liu para TRV-VIGS vetores, e as Dras. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr e Bayer CropScience para o fornecimento de sementes de algodão. Este trabalho foi financiado pela NSF para LS e NIH para PH

1. Crescer mudas de algodão <ol><li> Semear as sementes do algodão herbáceo (Gossypium hirsutum) variedade Fibermax 832, PhytoGen 425RF, PhytoGen 480WR e Deltapine 90 em vasos (7 cm de diâmetro) contendo Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Manter os vasos em uma bandeja coberta com uma cúpula de plástico a 23 ° C, 120 μE m -2 S luz -1, com um fotoperíodo 12 horas horas light/12 escuros em sala de crescimento. </li><li> Remova a cúpula quando dois cotilédones têm surgido. </l...

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	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

VIGS foi provado ser uma ferramenta poderosa na análise genômica funcional por transitoriamente derrubando a expressão de genes endógenos. Neste estudo, desenvolvemos um VIGS Agrobacterium mediada pela utilização de um vetor binário TRV-based. O algodão CLA1 gene (GrCLA1) foi desenvolvido como um marcador visual para monitorar a eficiência silenciar. Temos consistentemente obteve 100% de eficiência silenciamento gênico, demonstrado pelo fenótipo albino aparecendo nas folhas verdadeiras em t...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome dos reagentes e equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Catálogo / número de série </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Rolo de tambor </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bactéria cultura </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bactéria cultura </td></tr><tr><td> UV / Vis espectrofotômetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modelo: DU530 </td><td> Medição OD </td></tr><tr><td> Gene Pulser </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652076; Serial: 154BR3880 </td><td> Eletroporação </td></tr><tr><td> Pulsador Controlador </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652098; Serial: 232BR4833 </td><td> Eletroporação </td></tr><tr><td> Micropulser Eletroporação cuvete </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Eletroporação </td></tr><tr><td> 1 Seringa ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Inoculação de bactéria agro- </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Mudas em crescimento </td></tr><tr><td> Terra Cotta pot </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Mudas em crescimento </td></tr><tr><td> Monohidratada MES </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Buffer de infiltração </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Buffer de infiltração </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

Algodão (Gossypium hirsutum) é uma das culturas mais importantes do mundo. Esforços consideráveis ​​têm sido feitos sobre melhoramento molecular de novas variedades. A análise de genes em larga escala funcional em algodão tem sido ficado para trás a maioria das espécies de plantas modernas, provavelmente devido a seu grande tamanho do genoma, o gene duplicação e poliploidia, ciclo de crescimento longo e recalcitrância à transformação genética 1. Para facilitar o estudo funcional de alto rendimento genética / genômica em algodão, tentamos desenvolver rápida e eficiente ensaios transitórios para avaliar as funções dos genes do algodão. Virus-Induced silenciamento gênico (VIGS) é uma poderosa técnica que foi desenvolvida com base no host silenciamento pós-transcricional Gene (PTGS) para reprimir a proliferação viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS tem sido aplicado com sucesso em uma ampla gama de espécies como dicotiledôneas Solanaceae, Arabidopsis e espécies de leguminosas, e as espécies monocotiledôneas incluindo trigo, cevada e milho, por vários estudos genômicos funcionais 3,4. Como esta abordagem rápida e eficiente evita transformação de plantas e supera redundância funcional, é particularmente atraente e adequado para o estudo do genoma funcional de espécies de culturas como o algodão não passíveis de transformação. Neste estudo, relatamos o protocolo detalhado de Agrobacterium mediada sistema VIGS em algodão. Entre os vários vetores virais VIGS, o vírus chocalho tabaco (TRV) invade uma ampla gama de hospedeiros e é capaz de espalhar vigorosamente em toda a planta ainda produzir sintomas leves na hosts5. Para monitorar a eficiência silenciamento, GrCLA1, um gene homólogo de Cloroplastos Arabidopsis alterados um gene (AtCLA1) em algodão, foi clonado e inserido no vetor binário VIGS pYL156. CLA1 gene está envolvida no desenvolvimento do cloroplasto 6, e estudos anteriores demonstraram que perda de função de AtCLA1 resultou em um fenótipo albino em folhas verdadeiras 7, proporcionando um excelente marcador visual para silenciar eficiência. Em aproximadamente duas semanas infiltração Agrobacterium post, o fenótipo albino começaram a aparecer nas folhas verdadeiras, com eficiência de 100% em silenciar todos os experimentos replicados. O silenciamento da expressão do gene endógeno também foi confirmada por RT-PCR. Significativamente, silenciando poderia potently ocorrer em todas as cultivares testadas, incluindo diversas variedades comercialmente cultivadas em Texas. Essa rápida e eficiente mediada por Agrobacterium ensaio VIGS fornece uma ferramenta muito poderosa para a análise em larga escala rápida de funções dos genes no genoma nível em algodão.

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Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Apresentamos o protocolo detalhado para Agrobacterium mediada induzida pelo vírus ensaio de silenciamento de genes (VIGS) em algodão. O vírus chocalho tabaco (TRV) derivados de vetores VIGS foram mobilizados para induzir silenciamento de RNA de algodão GrCLA1, Cloroplastos alterados um gene. O fenótipo albino causada pelo silenciamento GrCLA1 ​​foi observada na fase de mudas dentro de 2 semanas após a inoculação.

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

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RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

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Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

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Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

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Agrobacterium-Transformação de embrião imaturo mediado de linhas de milho recalcitrante usando genes morfogênicos

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Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

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