Name: agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00
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Estamos muy agradecidos a los Dres. SP Dinesh-Kumar y Liu Yule para TRV-VIGS vectores, y los Dres. Chuck Kenerley, Wheeler Terry, Starr y Jim Bayer CropScience para el suministro de semillas de algodón. Este trabajo fue financiado por la NSF para LS y los NIH para PH

1. Crecer las plántulas de algodón <ol><li> Sembrar las semillas del algodón (Gossypium hirsutum) variedad FiberMax 832, Phytogen 425RF, 480WR Phytogen y Deltapine 90 en macetas (7 cm de diámetro) que contienen la mezcla Metro 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Mantenga los recipientes en una bandeja cubierta con una cúpula de plástico a 23 ° C, 120 μE m -2 S -1 luz, con un fotoperíodo de 12 horas light/12 horas oscuras en una sala de crecimiento. </li><li> Retire la terminal cuando dos...

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	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

VIGS ha demostrado ser una poderosa herramienta en el análisis de la genómica funcional de forma transitoria derribar la expresión de genes endógenos. En este estudio, hemos desarrollado un VIGS mediada por Agrobacterium mediante la utilización de un vector binario TRV-basado. El algodón CLA1 (GrCLA1) gen fue desarrollado como una marca visual para monitorear la eficiencia de silenciamiento. Siempre hemos obtenido el 100% de eficiencia de silenciamiento génico, como lo demuestra el fenotipo albino que ap...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre de los reactivos y equipos </th><th> Empresa </th><th> Catálogo / número de serie </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Rodillos de tambor </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bacteria cultura </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bacteria cultura </td></tr><tr><td> UV / Vis espectrofotómetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modelo: DU530 </td><td> La medición de OD </td></tr><tr><td> Gene Emisores </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652076, de serie: 154BR3880 </td><td> Electroporación </td></tr><tr><td> Generador de impulsos del controlador </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652098, de serie: 232BR4833 </td><td> Electroporación </td></tr><tr><td> Micropulser cubeta de electroporación </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Electroporación </td></tr><tr><td> 1 ml jeringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> La inoculación de las agro-bacteria </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Plántulas de crecimiento </td></tr><tr><td> Terra Cotta olla </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Plántulas de crecimiento </td></tr><tr><td> MES monohidrato </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> La infiltración de búfer </td></tr><tr><td> Acetosiringona </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> La infiltración de búfer </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

Algodón (Gossypium hirsutum) es uno de los cultivos más importantes del mundo. Los esfuerzos se han hecho considerables en la reproducción molecular de nuevas variedades. El análisis genético a gran escala funcional de algodón se ha quedado atrás la mayor parte de las especies de plantas modernas, probablemente debido a su gran tamaño de la duplicación del genoma, los genes y la poliploidía, largo ciclo de crecimiento y la obstinación a la transformación genética 1. Para facilitar el estudio funcional de alto rendimiento genética / genómica en algodón, tratamos de desarrollar ensayos transitoria rápida y eficiente para evaluar las funciones de genes de algodón. Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) es una poderosa técnica que fue desarrollada con base en el host post-transcripcional silenciamiento génico (PTGS) para reprimir la proliferación viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS ha sido aplicado con éxito en una amplia gama de especies dicotiledóneas como Solanaceae, Arabidopsis y otras especies de leguminosas y especies monocotiledóneas como la cebada, el trigo y el maíz, por diversos estudios de genómica funcional 3,4. Como este método rápido y eficaz evita la transformación de plantas y supera la redundancia funcional, es particularmente atractiva y adecuada para el estudio de genómica funcional en las especies de cultivos como el algodón no es susceptible de transformación. En este estudio, se presenta el protocolo detallado de Agrobacterium VIGS sistema en el algodón. Entre los varios vectores VIGS viral, el virus del cascabel del tabaco (TRV) invade una amplia gama de huéspedes y es capaz de propagarse con fuerza a lo largo de toda la planta sin embargo, producen síntomas leves en la hosts5. Para controlar la eficacia de silenciamiento, GrCLA1, un gen homólogo de Arabidopsis Cloroplastos Alterados un gen (AtCLA1) en el algodón, ha sido clonado y se inserta en el vector binario VIGS pYL156. CLA1 gen está involucrado en el desarrollo del cloroplasto 6, y estudios previos han demostrado que pérdida de función de AtCLA1 dio lugar a un fenotipo albino de 7 hojas verdaderas, proporcionando un excelente marcador visual para silenciar la eficiencia. En aproximadamente dos semanas después de la infiltración de Agrobacterium, el fenotipo albino comenzaron a aparecer en las hojas verdaderas, con una eficiencia del 100% en silenciar a todos los experimentos replicados. El silenciamiento de la expresión de genes endógenos también fue confirmado por RT-PCR análisis. Significativamente, el silenciamiento potente podría ocurrir en todas las variedades que hemos probado, incluyendo varias variedades cultivadas comercialmente en Texas. Esta rápida y eficiente mediada por Agrobacterium VIGS ensayo proporciona una herramienta muy poderosa para un rápido análisis a gran escala de las funciones de los genes en el genoma de nivel en el algodón.

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Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Se presenta el protocolo detallado para la mediada por Agrobacterium inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) de ensayo en el algodón. El virus del cascabel del tabaco (TRV) vectores derivados de VIGS fueron desplegados para inducir el silenciamiento de ARN de algodón GrCLA1, Alterados Cloroplastos un gen. El fenotipo albino causadas por el silenciamiento GrCLA1 ​​se observó en el estado de plántula dentro de 2 semanas después de la inoculación.

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Investigación

Biología

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por siRNA Identifica Ca 2 + Canales de fugas en la membrana del ER y sus mecanismos de regulación

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...