Name: agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton at JoVE.com

Vi är tacksamma att Dr. SP Dinesh-Kumar och Yule Liu för TRV-VIGS vektorer, och Dr. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr och Bayer CropScience för att ge bomullsfrön. Detta arbete har finansierats av NSF till LS och NIH till PH

1. Odla bomull plantor <ol><li> Så frön av den höglänta bomull (Gossypium hirsutum) sort Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR och Deltapine 90 i krukor (7 cm i diameter) som innehåller Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Håll krukor i en bricka täckt med en plast kupol vid 23 ° C, 120 μE m -2 s -1 ljus, med en 12 timmars light/12 timmars mörker fotoperiod i en tillväxtfas rum. </li><li> Ta bort kupolen när två hjärtblad har uppstått. </li><li> Ungefär två veckor...

<ol>
	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

VIGS har visat sig vara ett kraftfullt verktyg inom funktionell genomik analys av övergående knacka ner uttrycket av endogena gener. I denna studie har vi utvecklat en Agrobacterium-medierad VIGS genom att använda en TRV-baserade binär vektor. Bomullen CLA1 (GrCLA1) gen utvecklades som en visuell markör för att övervaka tysta effektivitet. Vi har genomgående fått 100% av geners uttryck effektivitet, vilket framgår av albino fenotyp som finns på den sanna löv i alla sorter testas, med början ungefä...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn på reagens och utrustning </th><th> Företag </th><th> Katalog / serienummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Roller trumma </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bakterie kultur </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bakterie kultur </td></tr><tr><td> UV / Vis spektrofotometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modell: DU530 </td><td> Mät OD </td></tr><tr><td> Gene Pulser </td><td> BioRad </td><td> Modell: 1652076; Serial: 154BR3880 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> Pulser Controller </td><td> BioRad </td><td> Modell: 1652098; Serial: 232BR4833 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> Micropulser elektroporation kyvett </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> 1 ml spruta </td><td> BD Biosciences </td><td> 30.962 </td><td> Inympning av agro-bakterie </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553.001 </td><td> Växande plantor </td></tr><tr><td> Terra Cotta pott </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Växande plantor </td></tr><tr><td> MES monohydrat </td><td> USB </td><td> 18.886 </td><td> Infiltration buffert </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Infiltration buffert </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

Bomull (Gossypium hirsutum) är en av de viktigaste grödorna i världen. Betydande insatser har gjorts på molekylär förädling av nya sorter. Den storskaliga genen funktionell analys i bomull har halkat efter de flesta moderna växtarter, sannolikt på grund av sin stora storlek genom, gen dubbelarbete och polyploidi, lång tillväxt cykel och motspänstighet för genetisk förändring 1. För att underlätta hög genomströmning funktionella genetiska / genetiska studier i bomull, försöker vi att utveckla snabb och effektiv övergående testmetoder för att bedöma funktioner bomull genen. Virusinducerade geners uttryck (VIGS) är en kraftfull teknik som har utvecklats baserat på värden efter transkriptionella geners uttryck (PTGS) att undertrycka virus spridning 2,3. Agrobacterium-medierad VIGS har framgångsrikt tillämpats i ett brett spektrum av dicots arter som Solanaceae, Arabidopsis och arter baljväxter och monocots arter, inklusive korn, vete och majs, för olika funktionella genomiska studier 3,4. Eftersom detta snabba och effektiva metoden undviker anläggning omvandling och övervinner funktionell redundans, är det särskilt intressant och lämplig för funktionell genomforskning studie i grödor som bomull inte mottagliga för förändring. I denna studie rapporterar vi den detaljerade protokoll från Agrobacterium-medierad VIGS system i bomull. Bland flera virala VIGS vektorer, invaderar tobak skallra virus (TRV) ett brett utbud av värdar och kan sprida sig kraftfullt genom hela anläggningen men ge lindriga symtom på hosts5. Att övervaka tysta effektivitet, GrCLA1, en ​​homolog gen i Arabidopsis Cloroplastos alterados 1-genen (AtCLA1) i bomull, har klonats och in i VIGS binära vektorn pYL156. CLA1 genen är inblandad i kloroplast utveckling 6, och tidigare studier har visat att förlust-av-funktion AtCLA1 resulterade i en albino fenotyp på äkta blad 7, vilket ger en utmärkt visuell markör för ljuddämpning effektivitet. Vid ungefär två veckor efter Agrobacterium infiltration började albino fenotypen ska visas på den sanna blad, med 100% tysta effektivitet i alla replikerade experiment. Den tysta endogena genuttryck bekräftades också av RT-PCR-analys. Betecknande nog kunde tysta förekomma kraftigt i alla de sorter vi testade, inklusive olika odlas kommersiellt sorter i Texas. Denna snabba och effektiva Agrobacterium-medierade VIGS analysen ger ett mycket kraftfullt verktyg för snabb storskalig analys av genen funktioner på arvsmassan-nivå i bomull.

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Vi presenterar detaljerade protokoll för Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck (VIGS) analys i bomull. Tobaken skallra virus (TRV)-härledda VIGS vektorer utplacerades att inducera RNA tysta av bomull GrCLA1, Cloroplastos alterados 1-genen. Den albino fenotyp orsakas av tysta GrCLA1 ​​observerades vid plantan skede inom 2 veckor efter ympningen.

Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck test på Bomull

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-inducerad geners uttryck (VIGS) i Nicotiana benthamiana Och Tomat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Levande cell Kalcium Imaging Kombinerat med siRNA Medierad geners uttryck Identifierar Ca 2 + Läckage kanaler i ER membranet och deras regleringsmekanismer

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosan / Störande RNA nanopartiklar Medierad geners uttryck i sjukdom Vector mygglarver

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotisk Spindle Bedömning i musoocyter av siRNA-medierad Ljuddämpning

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Dämpning av gnistan: CRISPR/Cas9 genom redigering i svagt elektrisk fisk

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Medierad omogen embryoomvandling av motsträviga majs inavlade linjer med morfogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-medierad genetisk omvandling, Transgen produktion, och dess tillämpning för studiet av manlig reproduktiv utveckling i Ris

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...