Name: high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل غوردون وبيتي مور مؤسسة ، ومبادرة العلوم UNCF / ميرك.

1. فحص لوحة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25G متوسط ​​النمو LB ، أغار 15G ، و1.5G carboxymethyl السليلوز (CMC) الركيزة إلى الماء المقطر 1L ، وتعقيم لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التعقيم ، والسماح لتبرد والمتوسطة إضافة المضادات الحيوية المناس?...

<ol>
	<li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels.">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li><li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+and+biofuels.">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li><li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum.">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+endoglucanase+III+(Cel12A)+from+Trichoderma+reesei.">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination.">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability.">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li><li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering.">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li><li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+(Thermotoga+maritima).">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I,+II,+and+III,+expressed+in+Escherichia+coli.">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li><li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+(EGL+1)+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems.">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li><li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+(CBHI.1)+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli.">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li><li>Howard, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli.">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes.">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li></ol>

بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تحديد سرعة سريعة وعالية من الأنزيمات نشطة ، مع الحد الأدنى من التلاعب. الكشف عن نشاط حساس جدا ، ويعكس نوعيا كمية النشاط داخل الخلية. سهولة استخدامه يجعل هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من المكتبات الانزيم ، وقلة فقط من التعبير الوظيفي في <e...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> عدد المنتجات </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> سيغما </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> الكونغو الأحمر </td><td> سيغما </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Carboxymethyl السليلوز </td><td> سيغما </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto أجار </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> لوحات الأحيائي </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli

الانزيمات سلولاز (endoglucanases ، cellobiohydrolases وglucosidases β) يتحلل السيليلوز إلى سكريات عنصر ، والتي بدورها يمكن تحويلها إلى وقود الكحول 1. كثفت احتمالات الإنزيمية من الكتلة الحيوية السليلوزية لتوفير الطاقة المتجددة الجهود الرامية إلى مهندس السليلوزات اقتصادية لإنتاج وقود 2. ذات أهمية خاصة هي السليلوزات 3-8 الفطرية ، والتي هي بالفعل قيد الاستخدام الصناعي للأغذية وتجهيز المنسوجات. تحديد المتغيرات النشطة بين مكتبة السليلوزات متحولة أمر بالغ الأهمية في عملية الهندسة ، ويمكن اختبار المزيد من المسوخ نشطة لتحسين خصائص و / أو تعرضوا لالطفرات إضافية. وقد أعاق الهندسة كفاءة السليلوزات الفطرية بسبب نقص الأدوات الوراثية للكائنات الحية المحلية والصعوبات في التعبير عن الانزيمات في يستضيف مغاير. في الآونة الأخيرة ، وضعت موريكاوا وزملاء العمل وسيلة للتعبير في E. القولونية المجالات الحفاز endoglucanases من jecorina H. 3،9 ، وهو فطر الصناعية المهمة التي لديها القدرة على إفراز السليلوزات بكميات كبيرة. وظيفية E. كما تم الإبلاغ عن التعبير القولونية السليلوزات من الفطريات الأخرى ، بما في ذلك Macrophomina phaseolina 10 و Phanerochaete ذهبية الأبواغ 11-12. نقدم طريقة لفحص إنتاجية عالية من النشاط endoglucanase الفطرية في E. القولونية. (الشكل رقم 1) يستخدم هذا الأسلوب المشترك الميكروبية صبغ أحمر الكونغو (CR) لتصور تدهور الأنزيمية من السليلوز carboxymethyl (CMC) التي تنمو على الخلايا المتوسطة الصلبة. ويتطلب فحص النشاط الكواشف غير مكلفة ، والتلاعب الحد الأدنى ، ويعطي نتائج لا لبس فيها كمناطق التدهور (&quot;هالات&quot;) في موقع مستعمرة. على الرغم من عدم تدبير كمية من النشاط الأنزيمي يحددها هذا الأسلوب ، وجدنا أن حجم الهالة يرتبط النشاط الأنزيمي الكلي في الخلية. وتوصيف مزيد من الحيوانات المستنسخة إيجابية تحديد الفرد ، نسبة البروتين للياقة البدنية. البكتيرية كله نشاط الخلية المقايسات التقليدية CMC / 13 CR تنطوي صب CMC آغار تحتوي على المستعمرات ، والتي هي عرضة للتلوث العرضي ، أو الثقافات تفرخ في الآبار آغار اللجنة العسكرية المركزية ، التي هي أقل قابلية لتجارب على نطاق واسع. نحن هنا التقرير تحسن وضع بروتوكول بتعديل أساليب غسل القائمة 14 لنشاط سلولاز : تتم إزالة الخلايا المزروعة في أطباق أجار CMC قبل CR تلطيخ. بروتوكول لدينا يقلل بشكل ملحوظ عبر تلوث وتدرجية عالية ، والسماح للفحص السريع للآلاف من الحيوانات المستنسخة. بالإضافة إلى H. الانزيمات jecorina ، أعربنا عن وفرزهم من المتغيرات endoglucanase aurantiacus Thermoascus والبنسليوم decumbens (كما هو موضح في الشكل 2) ، مما يوحي بأن هذا البروتوكول تنطبق على انزيمات من مجموعة من الكائنات الحية.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

وصفنا منخفضة التكلفة ، وأسلوب إنتاجية عالية للكشف عن النشاط endoglucanase الفطرية في<em&gt; E. القولونية.</em&gt; الأسلوب يعتمد على قراءات بصرية بسيطة من تدهور الركيزة ، لا يتطلب تنقية الإنزيم ، وتدرجية عالية. وهذا يسمح للفحص السريع للمكتبات واسعة من المتغيرات الانزيم.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...