Name: high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Gordon en Betty Moore Foundation, en door de UNCF / Merck Science Initiative.

1. Screening plaat voorbereiding <ol><li> Voeg 25g LB groeimedium, 15 g agar, en 1,5 g carboxymethylcellulose (CMC) substraat aan 1L gedestilleerd water, en de autoclaaf te steriliseren. </li><li> Na de autoclaaf, laat medium laten afkoelen en voeg de juiste antibiotica, en IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 100 urn. </li><li> Iedere gieting 200mL medium in vijf grote vierkante petrischaaltjes / bioassay trays (240 x 240 x 20mm of groter). Laat platen volledig drogen. </li></ol> 2. Endog...

<ol>
	<li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels.">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li><li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+and+biofuels.">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li><li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum.">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+endoglucanase+III+(Cel12A)+from+Trichoderma+reesei.">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination.">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability.">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li><li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering.">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li><li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+(Thermotoga+maritima).">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I,+II,+and+III,+expressed+in+Escherichia+coli.">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li><li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+(EGL+1)+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems.">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li><li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+(CBHI.1)+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli.">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li><li>Howard, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli.">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes.">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li></ol>

Het protocol hier beschreven staat stelt snel en high throughput identificatie van actieve enzymen, met een minimum aan manipulatie. Activiteit detectie is vrij gevoelig, en kwalitatief weerspiegelt de hoeveelheid activiteit in de cel. Het gebruiksgemak maakt deze methode geschikt voor een breed scala van enzym bibliotheken, slechts beperkt door de functionele expressie in E. coli. Bovendien is de activiteit van dit soort screening niet beperkt tot schimmel cellulasen, maar kan worden aangepast voor elke endogl...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Product nummer </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> Sigma </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> Congo Red </td><td> Sigma </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Carboxymethylcellulose </td><td> Sigma </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> Bioassay platen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli

Cellulase enzymen (endoglucanasen, cellobiohydrolasen, en β-glucosidase) hydrolyseren cellulose in de component suikers, die op zijn beurt kan worden omgezet in brandstof alcoholen 1. Het potentieel voor enzymatische hydrolyse van cellulosehoudende biomassa om duurzame energie te bieden heeft op meer inspanningen om cellulasen engineer voor een economische productie van brandstoffen 2. Van bijzonder belang zijn schimmel cellulasen 3-8, die al industrieel gebruikt voor voedingsmiddelen en textiel verwerken. Het identificeren van actieve varianten onder een bibliotheek van mutant cellulasen is cruciaal voor het engineeringproces, actief mutanten kan verder worden getest op verbeterde eigenschappen en / of onderworpen aan extra mutagenese. Efficiënte engineering van schimmel cellulasen werd belemmerd door een gebrek aan genetische tools voor inheemse organismen en door de moeilijkheden in de uiting van de enzymen in heterologe gastheer. Onlangs Morikawa en collega&#39;s ontwikkelden een methode voor het uitdrukken in E. coli de katalytische domeinen van endoglucanasen uit H. jecorina 3,9, een belangrijke industriële schimmel met de capaciteit om cellulasen in grote hoeveelheden afscheiden. Functionele E. coli expressie is ook gemeld voor cellulasen van andere schimmels, waaronder Macrophomina phaseolina 10 en Phanerochaete Chrysosporium 11-12. We presenteren een methode voor high throughput screening van schimmels endoglucanase activiteit in E. coli. (Fig 1) Deze methode maakt gebruik van de gemeenschappelijke microbiële kleurstof Congo rood (CR) te visualiseren enzymatische afbraak van carboxymethylcellulose (CMC) door de cellen kweken op vast medium. De activiteit test vereist goedkoop reagentia, minimale manipulatie, en geeft eenduidige resultaten zones van afbraak (&#39;halo&#39;) op de kolonie site. Hoewel een kwantitatieve meting van de enzymatische activiteit kan niet worden bepaald door deze methode, hebben we ontdekt dat Halo grootte correleert met een totale enzymatische activiteit in de cel. Verdere karakterisering van de individuele positieve klonen zal bepalen, ten opzichte van eiwitten fitness. Traditionele bacteriële hele cel CMC / CR-activiteit assays 13 te betrekken gieten agar met CMC op kolonies, die onderworpen is aan kruisbesmetting, of incuberen culturen in CMC agar putten, die minder vatbaar is voor grootschalige experimenten. Hier hebben we melding van een verbeterde protocol dat de bestaande wassen methoden 14 voor cellulase activiteit verandert: de cellen gekweekt op CMC agar platen zijn voorafgaand aan de CR vlekken verwijderd. Ons protocol vermindert kruisbesmetting en is zeer schaalbaar, waardoor de snelle screening van duizenden klonen. Naast de H. jecorina enzymen, hebben we uitgesproken en gescreend endoglucanase varianten uit de Thermoascus aurantiacus en Penicillium decumbens (getoond in Figuur 2), wat suggereert dat dit protocol is van toepassing op enzymen uit een reeks van organismen.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit in<em&gt; E. coli.</em&gt; De methode is gebaseerd op een eenvoudige visuele uitlezing van substraat degradatie, vereist geen enzymen zuivering, en is zeer schaalbaar. Dit maakt het mogelijk om een ​​snelle screening van grote bibliotheken van enzym varianten.

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Een test voor het meten van de activiteit van de Escherichia coli Induceerbare Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...