Name: high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation, und durch die UNCF / Merck Science Initiative finanziert.

1. Abschirmblech Vorbereitung <ol><li> Add 25g LB Nährmedium, 15g Agar und 1,5 g Carboxymethylcellulose (CMC) Substrat 1L destilliertes Wasser, und Autoklaven zu sterilisieren. </li><li> Nach dem Autoklavieren können mittel-bis kühl, und fügen Sie geeignete Antibiotika und IPTG zu einer Endkonzentration von 100 &amp;mgr;. </li><li> Gießen Sie 200 ml Medium in je 5 große quadratische Petrischalen / Bioassay Tabletts (240 x 240 x 20mm oder größer). Lassen Platten vollständig trocknen. </li></ol><p class="jove_t...

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	<li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels.">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li><li>Wilson, D. 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Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine schnelle und hohen Durchsatz Identifizierung von aktiven Enzymen, mit minimaler Manipulation. Bewegungsmelder ist ziemlich empfindlich und qualitativ spiegelt das Ausmaß der Aktivität innerhalb der Zelle. Seine einfache Bedienung macht diese Methode eignet sich für eine breite Palette von Enzym-Bibliotheken, die nur durch funktionelle Expression in E. begrenzt coli. Darüber hinaus ist Aktivitätsscreening dieser Art nicht zu Pilzcellulasen beschränk...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Produkt-Nummer </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> Sigma </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> Kongorot </td><td> Sigma </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Carboxymethylcellulose </td><td> Sigma </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-Agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> Bioassay-Platten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli

Cellulase-Enzyme (Endoglucanasen Cellobiohydrolasen und β-Glucosidasen) hydrolysieren Zellulose in Zucker-Komponente, die wiederum in Kraftstoff Alkohole 1 umgewandelt werden kann. Das Potenzial für die enzymatische Hydrolyse von Zellulose-Biomasse zu erneuerbarer Energie zu versorgen hat sich bemüht, Cellulasen für sparsamen Produktion 2 Ingenieur intensiviert. Von besonderem Interesse sind Pilzcellulasen 3-8, wobei die bereits industriell für Lebensmittel und Textilien verarbeitet wird. Kennzeichnung der aktiven Varianten unter einer Bibliothek von mutierten Cellulasen ist entscheidend für den Engineering-Prozess, aktive Mutanten können weitere für die verbesserten Eigenschaften und / getestet werden oder eine zusätzliche Belastung von Mutagenese. Effizientes Engineering von Pilzcellulasen hat durch einen Mangel an genetischer Werkzeuge für die einheimische Organismen und durch die Schwierigkeiten bei der Expression der Enzyme in heterologen Wirten behindert. Kürzlich entwickelte Morikawa und Mitarbeiter ein Verfahren zur Expression in E. coli der katalytischen Domäne von Endoglucanasen von H. jecorina 3,9, ein wichtiges Industriezentrum Pilz mit der Fähigkeit, Cellulasen in großen Mengen ausscheiden. Functional E. coli Expression wurde auch für Cellulasen aus anderen Pilzen, einschließlich Macrophomina phaseolina 10 und Phanerochaete chrysosporium 11-12 berichtet worden. Wir stellen eine Methode zur Hochdurchsatz-Screening von Pilzen Endoglucanaseaktivität in E. coli. (Abb. 1) Diese Methode verwendet das gemeinsame mikrobielle Farbstoff Kongorot (CR) auf den enzymatischen Abbau der Carboxymethylcellulose (CMC) von wachsenden Zellen auf festem Medium zu visualisieren. Der Aktivitätstest erfordert kostengünstige Reagenzien, minimale Manipulation, und gibt eindeutige Ergebnisse als Zonen des Abbaus (&quot;Halos&quot;) in der Kolonie vor Ort. Obwohl ein quantitatives Maß für enzymatische Aktivität kann mit dieser Methode nicht ermittelt werden, haben wir festgestellt, dass Halo Größe mit insgesamt enzymatische Aktivität in der Zelle korreliert. Die weitere Charakterisierung der einzelnen positiven Klone bestimmt, relative Protein Fitness. Traditionelle bakterielle ganze Zelle CMC / CR Aktivitätstests 13 beinhalten Gießen Agar mit CMC auf Kolonien, die Gegenstand einer Kreuzkontamination oder Inkubation Kulturen in CMC-Agar Brunnen, die weniger für großflächige Experimente ist. Hier berichten wir über ein verbessertes Protokoll, dass die bestehenden Waschverfahren 14 für Cellulase-Aktivität verändert: Zellen, die auf CMC-Agarplatten gezüchtet werden vor CR Färbung entfernt. Unser Protokoll reduziert Kreuzkontamination und ist hoch skalierbar, so dass das schnelle Screening von tausenden von Klonen. Neben H. jecorina Enzyme, haben wir zum Ausdruck gebracht und gesiebt Endoglucanase Varianten aus dem Thermoascus aurantiacus und Penicillium decumbens (siehe Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll für Enzyme, die aus einer Reihe von Organismen.

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High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Wir beschreiben eine niedrige Kosten, hohe Durchsatz-Verfahren zum Screening von Pilzen Endoglucanaseaktivität in<em&gt; E. coli.</em&gt; Die Methode beruht auf einer einfachen visuellen Ablesung der Substratabbau, erfordert keine Enzymreinigung und ist hoch skalierbar. Dies ermöglicht das schnelle Screening von großen Bibliotheken der Enzym-Varianten.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Forschung

Biologie

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

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Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

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We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

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The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

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Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...