Name: high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00
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この作品は、ゴードンとベティムーア財団、およびUNCF /メルク科学イニシアチブによって資金を供給された。

1。スクリーニングプレートの準備<ol><li> 25グラムのLB増殖培地、15グラム寒天、および1Lの蒸留水に1.5グラムカルボキシメチルセルロース（CMC）基板、および滅菌にオートクレーブを追加。 </li><li>オートクレーブ後、培地が適切な抗生物質を冷却し、追加することができますし、100μMの最終濃度になるようにIPTG。 </li><li> 5大正方形ペトリ皿/バイオアッセイ用トレイ（240 × 240 × 20mm以上大き?...

<ol>
	<li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels.">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li><li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+and+biofuels.">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li><li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum.">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+endoglucanase+III+(Cel12A)+from+Trichoderma+reesei.">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination.">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability.">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li><li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering.">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li><li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+(Thermotoga+maritima).">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I,+II,+and+III,+expressed+in+Escherichia+coli.">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li><li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+(EGL+1)+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems.">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li><li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+(CBHI.1)+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli.">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li><li>Howard, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli.">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes.">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、最小限の操作で、アクティブな酵素の迅速かつ高スループットの識別が可能になります。アクティビティ検知とはかなり敏感であり、質的に、細胞内のアクティビティの量を反映している。その使いやすさはE.の機能的発現によって制限、酵素ライブラリの広い範囲のためのこの方法が適しています大腸菌 。さらに、この種の活動のスクリーニン?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th>会社</th><th>製品番号</th></tr><tr><td> IPTG </td><td>シグマ</td><td> I1284 </td></tr><tr><td>コンゴ赤</td><td>シグマ</td><td> C6277 </td></tr><tr><td>カルボキシメチルセルロース</td><td>シグマ</td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td>シグマ</td><td> S1679 </td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 214030 </td></tr><tr><td>バイオアッセイプレート</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli

セルラーゼ酵素（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ-グルコシダーゼ）順番に燃料アルコール1に変換することができるコンポーネントの糖類、に加水分解セルロース。再生可能エネルギーを提供するために、セルロース系バイオマスの酵素加水分解の可能性は、経済的な燃料生産の2のセルラーゼを設計するための努力を強化している。特に興味深いのは、すでに食品や繊維製品の処理のために工業的に使用されている真菌セルラーゼ3-8、です。 変異セルラーゼのライブラリの間でアクティブなバリアントを識別することは、エンジニアリングプロセスにとって重要です。アクティブな変異体は、さらに改良された特性について試験及び/または付加変異導入を行うことができる。真菌セルラーゼの効率的なエンジニアリングは、ネイティブの生物の遺伝的なツールの欠如によっておよび異種宿主中で酵素を発現における困難によって妨げられている。最近、森川らは、E.で表現するための手法を開発大腸菌 H. jecorina 3,9、大量のセルラーゼを分泌する能力を有する重要な産業の真菌からのエンドグルカナーゼの触媒ドメイン。機能性E.大腸菌の発現はまた、Macrophomina phaseolina 10とPhanerochaeteクリソ 11月12日を含む他の真菌、からセルラーゼのために報告されています。 我々は、E.の真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニングのための方法を提示大腸菌 。 （ 図1）このメソッドは、固形培地上に生育している細胞によるカルボキシメチルセルロース（CMC）の酵素分解を視覚化する一般的な微生物色素コンゴレッド（CR）を使用しています。活性測定は、安価な試薬、最小限の操作を必要とし、コロニーのサイトでの劣化のゾーン（&quot;ハロー&quot;）として、明確な結果が得られます。酵素活性の定量的測定がこの方法によって決定することはできませんが、我々は、ハローのサ​​イズはセル内の総酵素活性と相関することを発見した。個々の陽性クローンのさらなる特徴は、相対的な蛋白質の適応度を決定します。 伝統的な細菌の全細胞CMC / CR活性アッセイ13はクロスコンタミネーション、または大規模な実験にはあまり適しているCMC寒天井戸、でインキュベート文化の対象となるコロニー、上に寒天を含むCMCを注ぐ伴います。ここでは、セルラーゼ活性のための14の既存の洗浄方法を変更する改良されたプロトコルを報告する：CMC寒天プレート上で増殖した細胞は、前のCRの染色に削除されます。我々のプロトコルが大幅にクロスコンタミネーションを低減し、クローンの数千の迅速なスクリーニングを可能にする、非常にスケーラブルです。 H.に加えてjecorina酵素は 、我々が表明していると、このプロトコルは、生物の範囲から酵素に適用可能であることを示唆し、Thermoascus aurantiacusとペニシリウムdecumbens（ 図2に示されている）からエンドグルカナーゼの変異体をスクリーニングした。

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High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

私達は中の真菌エンドグルカナーゼ活性をスクリーニングするために、低コスト、高スループットの方法を説明します<em&gt; E.大腸菌。</em&gt;メソッドは、基板の劣化のシンプルなビジュアル読み出しに依存している酵素の精製を必要とせず、非常にスケーラブルです。これは、酵素変異体の大規模なライブラリーの迅速なスクリーニングが可能になります。

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

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の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

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