Name: high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00
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이 작품은 고든 무어와 베티 재단에 의해 및 UNCF / 머크 과학 이니셔티브에 의해 투자되었다.

1. 심사 플레이트 준비 <ol><li> 25g LB 성장 매체, 15g 한천과 증류수 1L에 1.5g 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC) 기판 및 소독에 압력솥을 추가합니다. </li><li> autoclaving 후 적절한 항생제를 냉각하고 추가할 수 있도록 중간, 그리고 100μM의 최종 농도 IPTG. </li><li> 각 5 큰 사각형 배양 접시 / bioassay 트레이 (240 X 240 X 20mm 또는 더 큰)에 200mL 매체를 하거라. 접시가 완전히 건조하도록 허용합니다. </li></ol><p class...

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	<li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels.">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li><li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+and+biofuels.">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li><li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum.">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+endoglucanase+III+(Cel12A)+from+Trichoderma+reesei.">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination.">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability.">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li><li>Lantz, S. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+(EGL+1)+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems.">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li><li>Howard, R. 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여기에서 설명한 프로토콜은 최소한의 조작으로 활성 효소의 신속하고 높은 처리량 신분증을 수 있습니다. 활동 검출은 매우 민감하고, 질적으로 세포 내에서 활동의 양을 나타냅니다. 사용의 용이성은 E.의 기능적 표현에 의해 제한 효소 라이브러리의 광범위한이 방법은 적합 대장균. 또한 이런 종류의 활동 심사는 곰팡이 cellulases에 국한되지 않고 있지만 endoglucanase의 활동에 적용?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 제품 번호 </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> 시그마 </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> 콩고 레드 </td><td> 시그마 </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> 카르복시 메틸 셀룰로오스 </td><td> 시그마 </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto - 한천 </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> Bioassay 플레이트 </td><td> 써모 과학 </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli

Cellulase 효소 (endoglucanases, cellobiohydrolases 및 β - glucosidases) 차례로 연료 알콜 1로 변환할 수 있습니다 구성 요소 당분로 hydrolyze의 셀룰로오스. 신재생 에너지를 제공하기 위해 cellulosic 바이오 매스의 효소 가수 분해에 대한 잠재력은 경제적인 연료 생산 2 cellulases을 엔지니어 노력을 강화하고있다. 특히 관심이 이미 식품, 섬유 처리에 대한 산업상 사용되는 곰팡이 cellulases 3-8은 다음과 같습니다. 돌연변이 cellulases의 라이브러리 간의 적극적인 변종을 식별하는 것은 기술 프로세스에 중요합니다, 적극적인 돌연변이가 더욱 향상된 특성 및 / 또는 추가 테스트 돌연변이 유발을 받게 될 수 있습니다. 곰팡이 cellulases의 효율적인 엔지니어링은 기본 생물에 대한 유전자 도구의 부족으로하고 heterologous 호스트에있는 효소를 표현의 어려움에 의해 방해되었다. 최근 모리카와 동료 E.의 표현 방법을 개발 대장균 H. jecorina 3,9, 대량으로 cellulases을 분비하는 능력과 함께 중요한 산업 곰팡이에서 endoglucanases의 촉매 도메인. 기능성 E. 대장균 표현도 Macrophomina phaseolina 10 Phanerochaete chrysosporium 11-12 포함한 다른 곰팡이에서 cellulases에 대한보고되었습니다. 우리는 E.에 곰팡이 endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사에 대한 방법을 제시 대장균. (그림 1)이 방법은 고체 매체에 성장 세포에 의해 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC)의 효소 저하를 시각화하는 일반적인 미생물의 염색 콩고 레드 (CR)를 사용합니다. 활동 분석은 저렴한 시약, 최소한의 조작을 필요로하고, 식민지 사이트에서 열화의 지역 ( &quot;halos&quot;)로 모호하지 않은 결과를 제공합니다. 효소 활동의 양적 측정이 방법에 의해 결정되지 않을 수 있지만, 우리는 헤일로 크기가 셀에 총 효소 활동을 상호 것으로 나타났습니다. 개인 긍정적인 클론의 추가 특성은 상대적으로 단백질 적합성을 결정합니다. 전통적인 박테리아 전체 셀 CMC / CR 활동 assays 13 교차 오염, 또는 대규모 실험을 덜받을 수있는 것입니다 CMC 한천 우물에서 잠복기 문화의 적용을받습니다 식민지, 한천에 포함된 CMC를 따르고 포함됩니다. 여기 cellulase 활동 14 기존의 세척 방법을 수정 향상된 프로토콜을보고 : CMC 한천 플레이트에 성장 세포는 이전에 CR의 얼룩을 제거됩니다. 우리 프로토콜은 크게 교차 오염을 줄이고 클론 수천의 급속한 심사를 허용, 확장성이 높은 것입니다. H. 이외에 jecorina 효소, 우리가 표현하고이 프로토콜은 생물의 범위에서 효소에 적용할 수 있다고 제안, Thermoascus aurantiacus 및 Penicillium decumbens (그림 2 참조)에서 endoglucanase 변종을 검사.

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High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

우리의 곰팡이 endoglucanase 활동을위한 화면으로 저렴한 비용, 높은 처리량 방법을 설명<em&gt; E. 대장균.</em&gt; 방법은, 기판 저하의 단순한 시각적 판독에 의존 효소 정화를 필요로하지 않으며, 확장성이 높은 것입니다. 이것은 효소 변종 대형 도서관의 신속한 심사를 위해 수 있습니다.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

연구

생물학

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

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안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

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에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...