Name: high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Gordon och Betty Moore Foundation, och av UNCF / Merck Science Initiative.

1. Screening tallrik förberedelse <ol><li> Lägg 25g medelstora LB tillväxt, 15g agar och 1.5g karboximetylcellulosa (CMC) substrat till 1L destillerat vatten och autoklav för att sterilisera. </li><li> Efter autoklavering, låt medelstora svalna och tillsätt lämplig antibiotika och IPTG till en slutlig koncentration av 100μM. </li><li> Häll 200ml medelstora varje i 5 stora torget petriskålar / brickor bioassay (240 x 240 x 20 mm eller större). Låt plattorna torka helt. </li></ol> 2. En...

<ol>
	<li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels.">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li><li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+and+biofuels.">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li><li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum.">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+endoglucanase+III+(Cel12A)+from+Trichoderma+reesei.">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination.">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability.">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li><li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering.">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li><li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+(Thermotoga+maritima).">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I,+II,+and+III,+expressed+in+Escherichia+coli.">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li><li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+(EGL+1)+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems.">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li><li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+(CBHI.1)+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli.">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li><li>Howard, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli.">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes.">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li></ol>

Protokollet beskrivs här möjliggör snabb och hög kapacitet identifiering av aktiva enzymer, med minimal manipulation. Aktivitet upptäckt är ganska känsliga, och kvalitativt avspeglar mängden aktivitet i cellen. Dess användarvänlighet gör denna metod lämplig för ett brett spektrum av enzym bibliotek, endast begränsas av funktionella uttryck i E. coli. Dessutom är aktiviteten screening av detta slag inte begränsat till svamp cellulaser, men kan anpassas för alla endoglucanase aktivitet, eller nå...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Företag </th><th> Produktnummer </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> Sigma </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> Congo Red </td><td> Sigma </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Karboximetylcellulosa </td><td> Sigma </td><td> 360.384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214.030 </td></tr><tr><td> Bioassay plattor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240.845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli

Cellulas enzymer (endoglucanases, cellobiohydrolases och β-glucosidases) hydrolysera cellulosa till komponent socker, vilket i sin tur kan omvandlas till drivmedel alkoholer 1. Potentialen för enzymatisk hydrolys av cellulosa biomassa för att ge förnybar energi har intensifierat arbetet med att ingenjör cellulaser för ekonomisk bränsleproduktion 2. Av särskilt intresse är svamp cellulaser 3-8, som redan används industriellt för livsmedel och textilier bearbetning. Identifiera aktiva varianter bland ett bibliotek av mutant cellulaser är kritisk till den tekniska processen, aktiva mutanter kan testas ytterligare för förbättrade egenskaper och / eller utsatts för ytterligare mutagenes. Effektiv konstruktion av svamp cellulaser har försvårats av bristen på genetisk verktyg för infödda organismer och av svårigheter att uttrycka enzymer i heterologa värdar. Nyligen utvecklade Morikawa och medarbetare en metod för att uttrycka i E. coli den katalytiska domäner endoglucanases från H. jecorina 3,9, en viktig industriell svamp med kapacitet att utsöndra cellulaser i stora mängder. Funktionell E. coli uttryck har också rapporterats för cellulaser från andra svampar, inklusive Macrophomina phaseolina 10 och Phanerochaete chrysosporium 11-12. Vi presenterar en metod för hög throughput screening av svamp endoglucanase aktivitet i E. coli. (Fig 1) Den här metoden använder den gemensamma mikrobiella färgen Congo Red (CR) för att visualisera enzymatisk nedbrytning av karboximetylcellulosa (CMC) av celler som växer på fast substrat. Verksamheten analysen kräver billig reagenser, minimal manipulation, och ger entydiga resultat som zoner av nedbrytning (&quot;glorior&quot;) på kolonin platsen. Även ett kvantitativt mått på enzymatiska aktiviteten inte kan fastställas genom denna metod, har vi funnit att halo storlek korrelerar med total enzymatisk aktivitet i cellen. Ytterligare karakterisering av enskilda positiva kloner kommer att avgöra, relativ protein fitness. Traditionella bakteriell helcells CMC / CR aktivitet analyser 13 innebär att hälla agar innehåller CMC på kolonier, som är föremål för korskontaminering eller inkubera kulturer i CMC agar brunnar, vilket är mindre mottaglig för storskaliga experiment. Här rapporterar vi ett förbättrat protokoll som ändrar befintliga tvätta metoder 14 för cellulas aktivitet: celler odlas på CMC agarplattor tas bort före CR färgning. Vår protokoll minskar betydligt korskontaminering och är mycket skalbar, vilket gör att snabb screening av tusentals kloner. Förutom H. jecorina enzymer har vi uttryckt och avskärmade endoglucanase varianter från Thermoascus aurantiacus och Penicillium decumbens (visas i figur 2), vilket tyder på att detta protokoll tillämpas på enzymer från en rad olika organismer.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Vi beskriver en låg kostnad, hög genomströmning metod för att screena för svamp endoglucanase aktivitet i<em&gt; E. coli.</em&gt; Metoden bygger på en enkel visuell avläsning av substrat nedbrytning, inte kräver enzymet rening, och är mycket skalbart. Detta möjliggör en snabb screening av stora bibliotek av enzym varianter.

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Test för att mäta aktiviteten hos Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

En hög genomströmning skärm för Biomining cellulas aktivitet från Metagenomic bibliotek

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening för små molekyler Modulatorer för aktiv kanaler Likriktare Kalium

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Hög genomströmning Kvantitativ Expression Screening och rening Tillämpat på rekombinant Disulfide rika Venom proteiner som produceras i<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Det mångfacetterade Fördelar med Protein Samexpression i<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifiering av kinas-substrat par Använda högkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...