Name: high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

Bu çalışma, Gordon ve Betty Moore Vakfı tarafından ve UNCF / Merck Bilim Girişimi tarafından finanse edildi.

1. Tarama plaka hazırlığı <ol><li> , 25g LB besi, 15g Agar ve 1L distile su 1.5g karboksimetil selüloz (CMC) substrat ve sterilize etmek için otoklav ekleyin. </li><li> Otoklav sonra, uygun antibiyotik serin ve orta, izin ve nihai konsantrasyonu 100μM IPTG. </li><li> Her orta 200ml 5 büyük kare petri kaplarına / biyoassay tepsiler (240 x 240 x 20mm veya daha büyük) içine dökün. Plakaları tamamen kurumasına izin verin. </li></ol> 2. Endoglucanase kütüphane oluşturma ve ekran </...

<ol>
	<li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels.">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li><li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+and+biofuels.">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li><li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum.">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+endoglucanase+III+(Cel12A)+from+Trichoderma+reesei.">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination.">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li><li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability.">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li><li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering.">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li><li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+(Thermotoga+maritima).">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li><li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I,+II,+and+III,+expressed+in+Escherichia+coli.">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li><li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+(EGL+1)+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems.">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li><li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+(CBHI.1)+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli.">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li><li>Howard, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli.">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes.">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li></ol>

Burada açıklanan protokol minimal manipülasyon, aktif enzimler hızlı ve yüksek verimlilik kimlik sağlar. Hareketi algılama oldukça duyarlıdır ve niteliksel olarak hücre içinde aktivite miktarını yansıtır. Kullanım kolaylığı, sadece E. fonksiyonel ifadesi ile sınırlı, geniş bir enzim kütüphaneler için bu yöntemi uygun hale getirir coli. Ayrıca, bu tür aktivite tarama mantar sellülazlar sınırlı değildir, ancak herhangi bir endoglucanase faaliyet için adapte edilebilir...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Şirket </th><th> Ürün numarası </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> Sigma </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> Kongo Red </td><td> Sigma </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Karboksimetil Selüloz </td><td> Sigma </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> Biyoassay plakalar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening of fungal endoglucanase activity in escherichia coli

Selülaz enzimleri (endoglucanases, cellobiohydrolases ve β-glukozidaz) da yakıt alkoller 1 dönüştürülebilir bileşeni şekerlerin içine hidroliz selüloz. Selülozik biyokütle yenilenebilir enerji sağlamak için enzimatik hidroliz potansiyeli, ekonomik yakıt üretimi 2 için sellülazlar mühendisi çabaları yoğunlaşmıştır . Özellikle ilgi çekici olan, gıda ve tekstil işleme endüstride kullanılan mantar sellülazlar 3-8, . Mutant sellülazlar bir kütüphane arasında aktif varyantları belirlenmesi mühendislik süreci için kritik; aktif mutantlar, daha gelişmiş özellikler ve / için test veya ek mutagenez maruz olabilir. Etkin mühendislik mantar sellülazlar yerli organizmalar için genetik araçları eksikliği ve enzimler heterolog hosts ifade zorluklar engel olmuştur. Son zamanlarda, Morikawa ve arkadaşları E. ifade etmek için bir yöntem geliştirdi coli H. jecorina 3,9, büyük miktarlarda sellülazlar salgılaması için kapasitesi ile önemli bir sanayi mantar endoglucanases katalitik etki. Fonksiyonel E. coli ifade Macrophomina phaseolina 10 ve Phanerochaete chrysosporium 11-12 dahil olmak üzere diğer mantar, sellülazlar için de rapor edilmiştir. Biz E. mantar endoglucanase aktivitesi yüksek kapasiteli tarama için bir yöntem mevcut coli. (Şekil 1) Bu yöntem katı ortamda büyüyen hücreleri tarafından karboksimetil selüloz (CMC) enzimatik bozulma görselleştirmek için ortak bir mikrobiyal boya Kongo Red (CR) kullanır . Aktivite assay ucuz reaktifler, minimal manipülasyon gerektirir ve koloni yerinde bozulması bölgeleri (&quot;haleler&quot;) olarak net sonuçlar verir. Enzimatik aktivite nicel bir ölçüsüdür bu yöntemle tespit edilemez olsa da, biz hale boyutu hücredeki toplam enzimatik aktivite ile ilişkili olduğunu buldular. Ayrıca bireysel pozitif klonların karakterizasyonu, bağıl protein spor belirleyecektir. Geleneksel tüm bakteri hücre CMC / CR faaliyet deneyleri 13, koloniler, çapraz kontaminasyon, ya da büyük ölçekli deneyler daha az yatkın olan CMC agar kuyu, kuluçka kültürleri konu üzerine agar içeren CMC dökme içerir. Burada selülaz aktivitesi için 14 mevcut yıkama yöntemleri değiştiren gelişmiş bir protokol raporu: CMC agar plakaları yetiştirilen hücreler CR boyama önce kaldırılır. Bizim protokol çapraz bulaşmayı önemli ölçüde azaltır ve binlerce klon hızlı bir tarama sağlayan, son derece ölçeklenebilir. H. yanı sıra jecorina enzimler, biz dile getirdiler ve bu protokol organizmaların bir dizi enzimler için geçerli olduğunu düşündüren, Thermoascus aurantiacus ve Penicillium decumbens (Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi) endoglucanase varyantları gösterildi.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli at JoVE.com

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi tarif<em&gt; E. coli.</em&gt; Bu yöntem, substrat bozulması basit bir görsel okuma dayanır enzim saflaştırma gerektirmez ve yüksek ölçeklenebilir. Bu enzim varyantlarının büyük kütüphanelerin hızlı bir tarama sağlar.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...