Name: biochemical measurement of neonatal hypoxia
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00
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Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health NR011209 R01-03

1. Esempio di raccolta ed elaborazione <ol><li> Raccogliere campioni di sangue in una provetta con EDTA K3 K3E 6ml, che è tenuta in ghiaccio. </li><li> Entro 2 min di raccolta, centrifugare il campione a 4 ° C a 1500 g per 10 min. </li><li> Trasferire il surnatante (plasma) in una provetta 1,5 ml. </li><li> Centrifugare a 4 ° C a 18000 g per 30 min. </li><li> Rimuovere il surnatante aliquote e trasferirli in provette da microcentrifuga per purine (200μl), allantoina (50μl), MDA (100μl) e XO (120μl) analisi. Far...

<ol>
	<li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrapartum+hypoxia:+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites.">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li><li>Shalak, L., Perlman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic-ischemic+brain+injury+in+the+term+infant-current+concepts.">Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts.</a> Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).</li><li>Webster, W. S., Abela, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+in+development.">The effect of hypoxia in development.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).</li><li>Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xanthine+dehydrogenase+to+oxidase+in+ischemic+rat+tissues.">Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues.</a> J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).</li><li>Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+action+of+xanthine+oxidase.">Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase.</a> J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).</li><li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase:+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres.">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li><li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allantoin+in+human+plasma,+serum,+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress:+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations.">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li><li>Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+and+allantoin+levels+in+Down+syndrome:+antioxidant+and+oxidative+stress+mechanisms?.">Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?.</a> Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).</li><li>Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+thiobarbituric+acid-reacting+substances+as+potential+biomarkers+of+intrauterine+hypoxia.">Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia.</a> Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).</li><li>Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+hydroperoxide+and+advanced+oxidation+protein+products+in+preterm+hypoxic+babies.">Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies.</a> Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).</li><li>Berne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+nucleotides+in+hypoxia:+possible+role+in+regulation+of+coronary+blood+flow.">Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow.</a> Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).</li><li>Harkness, R. A., Lund, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+hypoxanthine,+xanthine,+uridine+and+inosine:+high+concentrations+of+the+ATP+metabolite,+hypoxanthine,+after+hypoxia.">Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia.</a> J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).</li><li>Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+markers+of+neonatal+hypoxia.">Biochemical markers of neonatal hypoxia.</a> Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).</li><li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection:+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li><li>Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+methyl+malondialdehyde+as+internal+standard+for+malondialdehyde+detection+by+capillary+electrophoresis.">Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis.</a> Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).</li><li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity.">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li><li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry:+what+is+needed+for+an+accurate+detection.">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li><li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li><li>Fasman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).</li><li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography/mass+spectrometry.">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li></ol>

I metodi descritti permettono la valutazione di ischemia ipossia neonatale. Questo protocollo combina la misurazione dei marcatori di energia (ATP) privazione, stress ossidativo, danno ossidativo, l&#39;attività enzimatica e di avere una visione globale biochimiche della presenza o anche il grado di ipossia, ischemia. Nonostante l&#39;utilità di questo metodo, ci sono delle limitazioni potenziale. In primo luogo, ci vogliono circa 1-2 ml di sangue per la raccolta del plasma sufficiente per eseguire tutti i test. Quest...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 6ml K3E EDTA K3 tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Con 13 e adattatore 16MM </td></tr><tr><td> Microcentrifuga 1,5 ml tubo </td><td> USA scientifico </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 spettrofotometro </td><td> Agilant Technologies </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron dispositivo centrifugo filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Colonna </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartuccia e titolare </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Acque </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GCMS Vial </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Allantoina -13 C-5, 1 -15 N </td><td> CDN Isotopi </td><td> M-2307 </td><td> Lotto # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Piridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Part # 5975E per GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio idrossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Benzene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Etere diisopropile </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Fenilidrazina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

biochemical measurement of neonatal hypoxia

Ischemia ipossia neonatale è caratterizzata da inadeguata perfusione sanguigna di un tessuto o una carenza sistemica di ossigeno. Questa condizione è pensato per causare / esacerbare ben documentate patologie neonatali compresi danni neurologici 1-3. Diminuzione della produzione di adenosina trifosfato si verifica a causa della mancanza di fosforilazione ossidativa. Per compensare questo molecole di energia priva di stato contenenti legami fosfato ad alta energia sono 2 degradati. Questo porta ad aumento dei livelli di adenosina, che viene successivamente degradato a inosina, ipoxantina, xantina, e infine ad acido urico. Gli ultimi due passaggi di questo processo di degradazione sono eseguite da xantina ossidoreduttasi. Questo enzima esiste in forma di xantina deidrogenasi in condizioni di normossia ma viene convertito in xantina ossidasi (XO) con ipossia-riperfusione circostanze 4, 5. A differenza di xantina deidrogenasi, XO genera perossido di idrogeno come sottoprodotto della degradazione delle purine 4, 6. Questo perossido di idrogeno in combinazione con altre specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) prodotte durante l&#39;ipossia, ossida l&#39;acido urico ad allantoina forma e reagisce con le membrane lipidiche per generare malondialdeide (MDA) 7-9. Maggior parte dei mammiferi, esseri umani esentati, in possesso dei uricasi enzima, che converte l&#39;acido urico ad allantoina. Negli esseri umani, tuttavia, allantoina può essere formata da ROS-mediate l&#39;ossidazione dell&#39;acido urico. Per questo motivo, allantoina è considerato un marker di stress ossidativo nell&#39;uomo, ma non nei mammiferi che hanno uricasi. Descriviamo impiegando metodi ad alta pressione (HPLC) e gas cromatografia e spettrometria di massa (GCMS) per misurare i marcatori biochimici di ischemia ipossia neonatale. Il sangue umano è utilizzato per maggior parte dei test. Sangue animale può essere utilizzato anche, pur riconoscendo il potenziale di uricasi generati allantoina. Metaboliti purinici sono stati legati all&#39;ipossia già nel 1963 e l&#39;affidabilità di ipoxantina, xantina, acido urico e come indicatori biochimici di ipossia neonatale è stato validato da vari ricercatori 10-13. Il metodo HPLC utilizzato per la quantificazione dei composti purinici è veloce, affidabile e riproducibile. Il GC / MS metodo utilizzato per la quantificazione del allantoina, un marker relativamente nuovo di stress ossidativo, è stato adattato da Gruber et al 7. Questo metodo evita certi artefatti e richiede bassi volumi di campione. I metodi utilizzati per la sintesi di MMDA sono stati descritti in altri 14, 15. GC / MS quantificazione basato su MDA è stato adattato da Paroni et al. e Cighetti et al. 16, 17. Xantina ossidasi è stata misurata mediante HPLC quantificando la conversione di pterina a isoxanthopterin 18. Questo approccio si è rivelato sufficientemente sensibile e riproducibile.

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Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Un metodo è descritto per misurare i marcatori biochimici di ischemia-ipossia neonatale. L&#39;approccio utilizza cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e gas cromatografia spettrometria di massa (GC / MS).

Misure biochimiche di ipossia neonatale

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to ...

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