Name: biochemical measurement of neonatal hypoxia
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00
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1。サンプルの収集と処理<ol><li>氷の上に保持されている6ミリリットルK3E EDTA K3チューブに血液サンプルを収集する。 </li><li>採取後2分以内に、4でサンプルを遠心℃で10分間1500 × gで。 </li><li> 1.5ml微量遠心チューブに上清（血漿）を転送する。 </li><li> 30分間18000グラムで4℃で遠心する。 </li><li>上清のアリコートを取り出して、プリン（200μlの）、アラントイン（50μlずつ）、MDA（100μL）、及...

<ol>
	<li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrapartum+hypoxia:+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites.">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li><li>Shalak, L., Perlman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic-ischemic+brain+injury+in+the+term+infant-current+concepts.">Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts.</a> Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).</li><li>Webster, W. S., Abela, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+in+development.">The effect of hypoxia in development.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).</li><li>Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xanthine+dehydrogenase+to+oxidase+in+ischemic+rat+tissues.">Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues.</a> J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).</li><li>Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+action+of+xanthine+oxidase.">Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase.</a> J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).</li><li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase:+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres.">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li><li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allantoin+in+human+plasma,+serum,+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress:+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations.">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li><li>Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+and+allantoin+levels+in+Down+syndrome:+antioxidant+and+oxidative+stress+mechanisms?.">Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?.</a> Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).</li><li>Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+thiobarbituric+acid-reacting+substances+as+potential+biomarkers+of+intrauterine+hypoxia.">Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia.</a> Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).</li><li>Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+hydroperoxide+and+advanced+oxidation+protein+products+in+preterm+hypoxic+babies.">Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies.</a> Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).</li><li>Berne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+nucleotides+in+hypoxia:+possible+role+in+regulation+of+coronary+blood+flow.">Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow.</a> Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).</li><li>Harkness, R. A., Lund, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+hypoxanthine,+xanthine,+uridine+and+inosine:+high+concentrations+of+the+ATP+metabolite,+hypoxanthine,+after+hypoxia.">Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia.</a> J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).</li><li>Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+markers+of+neonatal+hypoxia.">Biochemical markers of neonatal hypoxia.</a> Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).</li><li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection:+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li><li>Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+methyl+malondialdehyde+as+internal+standard+for+malondialdehyde+detection+by+capillary+electrophoresis.">Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis.</a> Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).</li><li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity.">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li><li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry:+what+is+needed+for+an+accurate+detection.">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li><li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li><li>Fasman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).</li><li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography/mass+spectrometry.">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li></ol>

メソッドは、新生児低酸素虚血の評価を許可するここで説明する。このプロトコルは存在、あるいは低酸素性虚血の程度の全体的な生化学的な像を得るためにエネルギー（ATP）剥奪のマーカーの測定、酸化ストレス、酸化的損傷、および酵素活性を兼ね備えています。この方法の有用性にもかかわらず、潜在的な制限があります。第一に、それは、アッセイのすべてを実行するのに十分なプ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> 6ミリリットルK3E EDTA K3チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> 5702R遠心</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 05413319 </td><td> 13＆16MMアダプタ付</td></tr><tr><td> 1.5ml微量遠心チューブ</td><td>米国サイエンティフィック</td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - アミノプリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td>バリアンキャリー100分光光度計</td><td> Agilantテクノロジーズ</td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td>サバントSpeed​​Vac </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SC210A - 115 </td><td></td></tr><tr><td>ミクロン遠心フィルターデバイス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC - 18 - Sカラム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC - 18 - S Supelguardカートリッジとホルダー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td>ウォーターズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> GCMSバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL -アラントイン- 5 -13℃、1 -15 N </td><td> CDNの同位体</td><td> M - 2307 </td><td>ロット＃L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td>アジレントテクノロジー</td><td> G7021A </td><td> 5975E GC / MSのための＃一部</td></tr><tr><td> 3 - Ethoxymethacrolein </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td>ベンゼン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td>ジイソプロピルエーテル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td>フェニルヒドラジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

biochemical measurement of neonatal hypoxia

新生児低酸素虚血は、組織の不十分な血液の灌流または酸素の全身欠如によって特徴づけられる。この条件は1-3神経学的障害を含む十分に文書化新生児疾患を引き起こす/悪化させると考えられている。減少アデノシン三リン酸の生産は、酸化的リン酸化の欠如が原因で発生します。高エネルギーリン酸結合を含むこのエネルギーを奪わ状態の分子を補償するためには2劣化している。これは、最終的に尿酸に、、ヒポキサン​​チン、キサンチンをイノシンに続いて分解されるアデノシンレベルの上昇につながる。この分解過程での最後の2つの手順は、キサンチン酸化還元酵素によって実行されます。この酵素は正常酸素条件下でのキサンチン脱水素酵素の形で存在するが、低酸素-再灌流障害の状況4、5の下にキサンチンオキシダーゼ（XO）に変換されます。キサンチン脱水素酵素とは ​​異なり、XOはプリン劣化4、6の副生成物として過酸化水素を生成します。低酸素時に生成される他の活性酸素種（ROS）と組み合わせて、この過酸化水素は、アラントインを形成するために尿酸を酸化し、マロンジアルデヒド（MDA）7-9を生成する脂質膜と反応する。 ほとんどの哺乳類は、人間が免除、どの酵素ウリカーゼを、持っているアラントインに尿酸に変換されます。ヒトでは、しかし、アラントインは尿酸のROSを介した酸化により形成することができます。このため、アラントインは、ヒトの、ではなく、ウリカーゼを持っている哺乳動物における酸化ストレスのマーカーであると考えられている。 我々は、新生児低酸素虚血の生化学的マーカーを測定するために、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）及びガスクロマトグラフィー質量分析（GCMS）を用いる方法を説明します。 ヒトの血液はほとんどのテストのために使用されます。ウリカーゼ生成されたアラントインの可能性を認識しつつ、動物の血液を使用することもできます 。プリン代謝は1963年、早ければ低酸素症およびヒポキサンチン、キサンチンの信頼性にリンクされていた、と新生児低酸素症の生化学的指標としての尿酸はいくつかの研究者10月13日によって検証した。プリン化合物の定量に用いるHPLC法は、高速で信頼性、および再現性です。アラントイン、酸化ストレスの比較的新しいマーカーの定量化に使用するGC / MS法は、グルーバーら 7から適応されました。このメソッドは、特定のアーティファクトを回避し、試料の少量を必要とします。 MMDAの合成に使用される方法は、他の場所に14 15を説明された。 MDAのGC / MSによる定量がParoni らから翻案されました。とCighetti ら 16、17。キサンチンオキシダーゼ活性はisoxanthopterin 18にプテリンの変換を定量化することによってHPLCにより測定した。このアプローチでは十分な感度と再現性であることが判明した。

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Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

メソッドは、新生児低酸素虚血の生化学的マーカーを測定するために記述されています。アプローチは、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）およびガスクロマトグラフ質量分析法（GC / MS）を利用しています。

新生児低酸素症の生化学的測定

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

新生児仮死の新型モデル

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

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