Name: lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Diese Studie wird von NIH DC052256 und DC006015 und NSF 0324769 zu QG und T32-DC008072 BS unterstützt.

1. Vorbereitung Dieses Verfahren ist Sicherheitsstufe 2, also all die folgenden Vorbereitungen sind in einem biohazard Haube, wo die Mikroinjektion Verfahren durchgeführt hat. <ol><li> Vorbereitung und Vorwärmung einem 37 ° C Wasserbett: Füllen Sie eine Plastik Aufbewahrungstasche mit Wasser - Dichtung und auf eine entleerte Heizblock Inkubator. Dies ermöglicht Mäusen nach Injektion zu erholen. </li><li> Füllen Sie ein biohazard Abfallbehälter mit 10% Bleichmittel auf eine...

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Mikroinjektion von Lentivirus führt zu einer dauerhaften Übertragung von Gen-Konstrukten in OSN genomischer DNA. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, kurzfristige oder langfristige Manipulationen von Kandidatengenen über Überexpression oder shRNA vermittelten knock-down durchzuführen. Darüber hinaus können wir Fluoreszenz-Label einzigen OSNs in eine vorhandene transgene Maus Linie Co-Lokalisation von Geruchsrezeptoren Populationen zu beobachten. Mikroinjektion ist für lentivirale Transduktion OSNs erforderlich. Wir...

Mikroinjektion: Neugeborene Mäuse wurden mikroinjiziert mit einem 5μL Hamilton-Spritze (Hamilton # 7647-01) mit einer 33-Gauge-Nadel (Hamilton # 7762-06) ausgestattet. Immunocytochemistry Reagenzien: Primärantikörper: polyklonalen Kaninchen-Antikörper GFP (Molecular Probes # A-6455), Huhn polyklonalen Antikörper gegen OMP (custom) (Chen et al, 2005.), Meerschweinchen polyklonalen Antikörpers gegen VGLUT2 (Millipore # AB2251). Sekundärantikörper: Cy2-konjugierten Esel-anti-Kaninchen (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-konjugierten Esel-anti-Huhn (Jackson Immunolab # 703-165-155) und Cy5-konjugierten Ziege anti-Meerschweinchen (Jackson Immunolab # 106-175-008). Die Schnitte wurden auf Glasplättchen mit Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) mit 50ng/mL DAPI Chromatin Färbelösung montiert. Konfokale Bildgebung: Z-Stapel-Aufnahmen wurden mit einer Olympus Flouview FV1000 konfokalen Mikroskop und Bilder gesammelt und in 3D-Projektionen mit Olympus FV10-ASW 2,01 konfokale Erfassung und Analyse-Software verarbeitet.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Entwicklung eines präzisen olfaktorischen Schaltung basiert auf präzisen Projektion Riechzelle (OSN) Axone ihre synaptischen Ziele im Riechkolben (OB). Die molekularen Mechanismen der OSN Axonwachstum und Targeting sind nicht gut verstanden. Manipulation der Genexpression und die anschließende Visualisierung der einzelnen OSN Axone und deren Terminal Laube Morphologie haben bislang eine Herausforderung. Zur Untersuchung der Genfunktion in der einzelnen Zelle Ebene innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens, entwickelten wir eine lentivirale basierende Technik, um die Genexpression in OSNs in vivo zu manipulieren. Lentivirale Partikel werden OSNs durch Mikroinjektion in die olfaktorischen Epithels (OE) geliefert. Expressionskassetten sind dann permanent in das Genom der transduzierten OSNs integriert. Das grün fluoreszierende Protein-Expression identifiziert infiziert OSNs und skizziert ihre gesamte Morphologie, einschließlich der Axonterminal Laube. Aufgrund der kurzen Zeitspanne zwischen Mikroinjektion und Reporter-Erkennung kann Genfunktion Studien in einem sehr engen Zeitraum der Entwicklung konzentrieren. Mit dieser Methode haben wir die GFP-Expression innerhalb von nur 3 Tage erkannt und so lange wie 3 Monate nach der Injektion. Wir haben sowohl Überexpression und shRNA vermittelten knock-down von lentiviralen Mikroinjektion erreicht. Diese Methode liefert detaillierte Morphologien der OSN Zellkörper und Axone an der einzelnen Zelle Ebene in vivo, und ermöglicht damit die Charakterisierung der Kandidaten-Gen-Funktion während olfaktorischen Entwicklung.

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Wir präsentieren einen lentiviralen Technik zur genetischen Manipulation und Visualisierung von einzelnen Riechzelle Axon und seine Endverzweigung<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...