Name: lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Questo studio è sostenuto da NIH DC052256 e DC006015, e NSF 0.324.769 di QG e T32-DC008072 a BS.

1. Preparazione Questa procedura è biosicurezza di livello 2, quindi tutti i preparativi sono apportate le seguenti in una cappa rischio biologico in cui si svolge la procedura di microiniezione. <ol><li> Preparare e preriscaldare a 37 ° C ad acqua: Riempire un sacchetto di plastica con acqua di stoccaggio - tenuta e impostare su un svuotato riscaldamento blocco incubatore. Questo permetterà di recuperare i topi dopo l&#39;iniezione. </li><li> Riempire un contenitore di rischio...

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Microiniezione di risultati lentivirus in trasferimento definitivo di costrutti del gene nel DNA genomico OSN. Questo approccio ci permette di eseguire manipolazioni a breve termine oa lungo termine di geni candidati attraverso l&#39;iperespressione o mediata shRNA knock-down. Inoltre, siamo in grado di fluorescenza etichetta OSNs singolo in una linea esistente topo transgenico per osservare co-localizzazione delle popolazioni di recettore olfattivo. Microiniezione è necessaria per la trasduzione lentivirale di OSNs. A...

Microiniezione: topi appena nati sono stati microiniettati 5μL utilizzando una siringa Hamilton (Hamilton # 7647-01) con ago 33 gauge (Hamilton # 7762-06). Reagenti Immunocitochimica: anticorpi primari: GFP anticorpi policlonali di coniglio (Molecular Probes # A-6455), anticorpi policlonali contro pollo OMP (custom) (Chen et al, 2005.), Maiale d&#39;India anticorpi policlonali contro VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorpi secondari: Cy2 coniugato asino anti-coniglio (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-coniugati asino anti-pollo (Jackson Immunolab # 703-165-155) e Cy5-capra coniugato anti-cavia (Jackson Immunolab # 106-175-008). Le sezioni sono state montate su vetrini con Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) con la soluzione 50ng/mL DAPI cromatina macchia. Confocale Imaging: Z-stack immagini sono state scattate con una Olympus Flouview FV1000 microscopio confocale e le immagini raccolte e trasformate in proiezioni in 3D utilizzando Olympus FV10-ASW acquisizione confocale 2.01 e software di analisi.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Sviluppo di un circuito preciso olfattivo si basa sulla proiezione accurata dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) assoni ai loro bersagli sinaptici nel bulbo olfattivo (OB). I meccanismi molecolari della crescita degli assoni OSN e targeting non sono ben compresi. L&#39;espressione genica e la successiva manipolazione di visualizzazione degli assoni OSN singoli e la loro morfologia terminale pergolato finora sono stati difficili. Per studiare la funzione dei geni a livello di singola cellula all&#39;interno di un periodo di tempo specificato, abbiamo sviluppato una tecnica basata lentivirale per manipolare l&#39;espressione genica in OSNs in vivo. Particelle lentivirali sono consegnati a OSNs dalla microiniezione nell&#39;epitelio olfattivo (OE). Cassette di espressione sono poi definitivamente integrata nel genoma di OSNs trasdotte. Espressione della proteina fluorescente verde identifica OSNs infetti e delinea la loro morfologia, inclusi il terminale assone pergolato. A causa del tempo di risposta brevi tra microiniezione e la rilevazione giornalista, studi di funzione del gene può essere concentrato in un periodo molto ristretto di sviluppo. Con questo metodo, abbiamo rilevato espressione GFP all&#39;interno da un minimo di tre giorni e fino a tre mesi dopo l&#39;iniezione. Abbiamo raggiunto entrambi over-espressione e shRNA mediata knock-down da microiniezione lentivirali. Questo metodo fornisce morfologie dettagliate di corpi cellulari OSN e assoni a livello di singola cellula in vivo, e permette quindi la caratterizzazione della funzione del gene candidato durante lo sviluppo olfattivo.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Vi presentiamo una tecnica lentivirali per la manipolazione genetica e la visualizzazione di singoli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e la sua arborizzazione terminale<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Ricerca

Neuroscienze

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-imaging di traslocazione della PKC in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

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Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

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Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

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Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...