Name: lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00
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Este estudio es apoyado por el NIH y DC052256 DC006015, y NSF 0324769 de QG y T32-DC008072 a BS.

1. Preparación Este procedimiento es la bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, todos los preparativos se hacen las siguientes en una campana de riesgo biológico donde se realiza el procedimiento de microinyección. <ol><li> Preparar y precalentamiento a 37 ° C cama de agua: Llene una bolsa de plástico con agua - sello y situado en un bloque vacío de calefacción incubadora. Esto permitirá que los ratones a recuperarse después de la inyección. </li><li> Llenar un recipiente...

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Microinyección de lentivirus resultados en la transferencia permanente de construcciones de genes en el ADN genómico OSN. Este enfoque nos permite realizar manipulaciones a corto plazo oa largo plazo de genes candidatos a través de la sobreexpresión o mediados del shRNA knock-down. Además, se pueden etiquetar con fluorescencia OSN solo en una línea de ratones transgénicos existentes para observar la co-localización de las poblaciones de receptores odoríferos. Microinyección es necesaria para la transducción l...

Microinyección: Los ratones recién nacidos fueron microinyección con una jeringa Hamilton 5μL (Hamilton # 7647-01) equipado con una aguja de calibre 33 (Hamilton # 7762-06). Inmunocitoquímica Reactivos: Los anticuerpos primarios: GFP anticuerpo policlonal de conejo (Molecular Probes # A-6455), el anticuerpo policlonal de pollo en contra de OMP (personalizado) (Chen et al, 2005.), Guinea anticuerpo policlonal de cerdos contra la VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticuerpos secundarios: Cy2-burro conjugado anti-conejo (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-burro conjugado anti-pollo (Jackson Immunolab # 703-165-155) y Cy5-conjugado de cabra anti-conejillo de indias (Jackson Immunolab # 106-175-008). Las secciones fueron montadas en portaobjetos de vidrio con Fluoromount G (Southern Biotech # 0010 a 01) con la solución de DAPI 50ng/mL cromatina mancha. Microscopía confocal: Z-stack imágenes fueron tomadas con una Olympus FV1000 Flouview microscopio confocal e imágenes recogidos y tratados en las proyecciones en 3D usando las baterías Olympus FV10-ASW adquisición de 2,01 confocal y análisis de software.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Desarrollo de un circuito olfativo precisa se basa en la proyección exacta de las neuronas sensoriales olfativas (OSN), los axones hacia sus objetivos sináptica en el bulbo olfatorio (OB). Los mecanismos moleculares de la OSN crecimiento de los axones y la selección no se comprenden bien. Manipulación de la expresión génica y posterior visualización de los axones OSN único y su morfología terminal de jardín hasta el momento han sido todo un desafío. Para estudiar la función génica en el nivel de células individuales dentro de un plazo determinado, hemos desarrollado una técnica basada en lentiviral para manipular la expresión génica en OSN en vivo. Partículas lentiviral se entregan a OSN por microinyección en el epitelio olfatorio (EO). Casetes de expresión de forma permanente se integra en el genoma de la OSN transducidas. Expresión de la proteína fluorescente verde identifica OSN infectados y describe su morfología completa, incluido el jardín axón terminal. Debido a los plazos de entrega cortos entre la microinyección y la detección de periodista, los estudios de la función genética se puede enfocar en un plazo muy limitado de desarrollo. Con este método, se ha detectado la expresión de GFP en tan sólo tres días y hasta tres meses después de la inyección. Hemos logrado por la sobre-expresión y del shRNA mediada por knock-down por microinyección lentiviral. Este método proporciona morfologías detallada de los cuerpos celulares y axones OSN en el nivel de células individuales en vivo, y por lo tanto permite la caracterización de la función de genes candidatos durante el desarrollo del olfato.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Se presenta una técnica de lentivirus de la manipulación genética y la visualización de un solo axón neuronas sensoriales olfativas y su arborización terminal de<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Investigación

Neurociencias

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...