Name: lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Denna studie stöds av NIH DC052256 och DC006015, och NSF 0.324.769 till QG och T32-DC008072 till BS.

1. Förberedelser Detta förfarande är biosäkerhetsnivå 2, därför att följande förberedelser är gjorda i ett biologiskt huva där mikroinjektion proceduren utförs. <ol><li> Förbered och värm en 37 ° C vattensäng: Fyll en plast förvaringsväska med vatten - tätning och ligger på en tömd värmeblock inkubator. Detta gör att möss att återhämta sig efter injektion. </li><li> Fyll en biologiskt avfall behållare med 10% blekmedel till en lämplig volym för nedsän...

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Mikroinjektion av lentivirus resulterar i permanent överföring av genen konstruktioner i OSN arvsmassans DNA. Detta tillvägagångssätt tillåter oss att göra kortsiktiga eller långsiktiga manipulationer av gener via överuttryck eller shRNA medierad knock-down. Dessutom kan vi etiketten fluorescerande enda OSN i en befintlig transgen mus linje att följa co-lokalisering av befolkningen luktreceptor. Mikroinjektion krävs för Lentiviral transduktion av OSN. Vi har försökt spola lentivirus fjädring i näshålan ...

Mikroinjektion: Nyfödda möss idag injiceras med hjälp av en 5μL Hamilton spruta (Hamilton # 7647-01) försedd med en 33 gauge nål (Hamilton # 7762-06). Immuncytokemi Reagens: Primär antikroppar: kanin polyklonala antikroppen GFP (molekylära sonder # A-6455), kyckling polyklonala antikroppar mot OMP (anpassad) (Chen et al, 2005.) Marsvin polyklonala antikroppar mot VGlut2 (Millipore # AB2251). Sekundära antikroppar: Cy2-konjugerat åsna anti-kanin (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-konjugerat åsna-anti-kyckling (Jackson Immunolab # 703-165-155) och Cy5-konjugerat get-anti-marsvin (Jackson Immunolab # 106-175-008). Avsnitten var monterade på objektglas med Fluoromount G (Södra Biotech # 0010-01) med 50ng/mL DAPI kromatin bets lösning. Konfokala Imaging: Z-stack bilder är tagna med en Olympus Flouview FV1000 konfokalmikroskop och bilder samlas in och bearbetas i 3D därvid använda Olympus FV10-ASW 2,01 konfokala förvärv och analysprogram.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Utveckling av en exakt lukt krets bygger på exakt prognos över luktsinnet sensoriska neuron (OSN) axoner till sina synaptiska mål i luktbulben (OB). De molekylära mekanismerna för OSN axon tillväxt och riktar förstås inte heller bra. Manipulera genuttryck och efterföljande visualisering av enstaka OSN axoner och deras terminal berså morfologi har hittills varit utmanande. För att studera geners funktion på cell nivå inom en angiven tidsram, utvecklade vi en Lentiviral baserad teknik för att manipulera genuttryck i OSN in vivo. Lentiviral Particles levereras till OSN genom mikroinjektion i luktepitel (OE). Expression kassetter sedan permanent integreras i genomet av transduced OSN. Grönt fluorescerande protein uttryck identifierar infekterade OSN och beskriver hela sin morfologi, inklusive axonet terminalen bersån. På grund av den korta handläggningstid mellan mikroinjektion och reporter upptäckt kan genfunktion studier fokuseras inom ett mycket smalt period av utveckling. Med denna metod har vi upptäckt GFP uttryck inom så lite som tre dagar och så länge som tre månader efter injektionen. Vi har uppnått både över-uttryck och shRNA medierade knock-down av Lentiviral mikroinjektion. Denna metod ger detaljerad morfologier av OSN cell organ och axoner på enskild cell nivån in vivo och därmed möjliggör karakterisering av kandidatgener geners funktion under olfactory utveckling.

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Vi presenterar en Lentiviral teknik för genetisk manipulation och visualisering av enstaka luktsinnet sensoriska neuron axon och sin terminal arborization<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-medierad genetisk manipulation och visualisering av Olfactory sensoriska neuroner In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Analysera svar av Mouse Olfactory sensoriska neuroner Använda Air-fas Electroolfactogram inspelning

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Inriktning luktbulben nervceller som använder kombinerade In Vivo Elektroporation och Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash Fotolys av Caged föreningar i Cilia av Olfactory sensoriska neuroner

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektiv Viral nervsystemet av vuxna födda Olfactory Neuroner för kronisk In vivo Optogenetic Stimulering

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforerade Patch-clamp inspelning av Mouse Olfactory sensoriska neuroner i Intakt neuroepithelium: Funktionell analys av nervceller som uttrycker en identifierad luktreceptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...