Name: isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00
Duration: 18 min 10 s
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この作品は、パリ市から医療研究助成金、フランス国立助成金ANR - 09 - JCJC - 0118 - 1、およびno ERCの開始グラントRNAvirusPopDivNVaxプロジェクトからの資金によって支えられている。 242719。

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	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞株の選択は。RNA変異原性物質として塩基類似体の効果は、異なる細胞型11によるそれらの相対的な取り込みと相関する。通常、ウイルスの継代に使用される細胞株は、取り込みや敏感すぎ（高い細胞毒性を）変異原性物質に不応性であることが判明した場合、それはこれらの要件を満たしていると、まだウイルス複製に許容である別の細胞株を使用する必要があります。変異原性の抵抗のバリアントが分離されると、特性の残りの部分はオリジナルの、好ましい細胞ラインで実行することができます。我々の経験では、HeLa細胞は容易に変異を取る、BHK細胞は変異の取り込みに抵抗性の10倍高い濃度およびVero細胞にまで必要とする。 変異原性の複数のタイプが使用されている場合は変異原性物質の選択は。変異処理により忠実度の亜種を分離しようとするには、成功の可能性を高めることができます。誤って複製中にゲノムに組み込まれている別の構造の基本アナログ変異原性物質は、主にその後の複製サイクルにおける突然変異の特定のサブセットの結果を誘発する：リバビリンの治療はGtoAとCtoU遷移変異12を支持し、5 -アザシチジンはと、同じようなバイアスを持っていますCtoGとGtoCトランスバージョン13の加算は、5 -フルオロウラシル優先エイトグと宇徳遷移14を誘導する。また、Mg 2 +のまたはMn 2の高濃度は、+ 12、上記のバイアスなしでRNAウイルスの全体的な突然変異の頻度を増加させる培地に補足することができます。ウイルスのコドンの配列、および忠実度のバリアントを生成するために必要なコドンの変化に応じて、これらの条件のいくつかは他のものに比べてこの変種の出現を優先します。忠実度の高いポリオウイルスG64SおよびコクサッキーウイルスA372V、コドンのサイトで必要なエイトグの遷移が主にこのリバビリンによって生成される突然変異に相当するので、最も容易に亜種のために選択されたリバビリンの治療のために。 MOI対人口サイズ。ウイルス感染症領域では、組織培養感染のプロトコルはのために、欠陥干渉粒子（低MOI）の蓄積を避けるために、またはウイルス（高MOI）との間で組換えを促進するため、感染の多重度（MOI）に特に注意を払う例。継代シリアルオーバー出現のイベントのために選択するには、ウイルスの人口規模を考慮することも重要です。耐性変異株は、当初は低頻度で存在するので、それは各通路にこれらの新興の変種を失うのを避けるために（10 5 -10 6ウイルス、など）次の1つの通路から、できるだけ多くの人口のサイズとして転送することが最善です。よくまたはフラスコの大きさ（感染した細胞の数）をスケールアップすること、これが問題になる場合MOIの増加を最小限に抑えるために役立つことがあります。一方、変異原性物質に対するウイルスの感受性がテストされている実験のために、低MOI感染は実験で発生する複製のサイクル数を増やすこととによってより高い適応度のゲノムで変異ゲノムの救助を避けるために行われ共同感染細胞における相補。複製の最初のラウンドの間に子孫のゲノム上で生成された変異がすぐに検出されないので、これは重要です。これらの変異RNAのほとんどは、依然としてビリオンにパッケージ化されます。それはこれらのゲノムに存在する致死突然変異が中止された複製サイクルにつながる、とウイルス力価の低下することを感染症の次のラウンドになります。それは致死突然変異誘発の有意な効果が観察される前に、変異の蓄積のいくつかのラウンドを可能にするために必要となる場合があります。最後に、変異原性物質の存在下で継代のシリーズを介して、ウイルスの力価が絶滅するまで低下し続ける場合は、研究者は徐々に変異原性物質（非常に低濃度から開始する）の量を増やすことで、ウイルスを継代してみてください。 RNA変異-抵抗性個体群からRNA変異原性物質耐性クローンの単離と世代。RNA変異原性物質は、それぞれのゲノムに複数のランダムな突然変異を導入するが、抵抗の選択は、唯一の（とコンセンサス配列に修正）耐性変異を豊かにする。この変異を識別するには、我々の配列変異の抵抗性の人口（人口のコンセンサス）ではなく、個々のウイルス。したがって、変異原によって作成された単一の、ランダムな突然変異が連続して検出されていない、唯一の変異は選択した後のコンセンサスの変化にその結果が、発見されています。我々の経験では、1つまたは2つだけそのようなコンセンサス配列の変更を識別します。変異原物質抵抗性個体群が得られ、耐性変異が同定されれば、それはこの亜種の多くの純粋な株式を生成する必要があります。上記の、我々は、プラーク精製の手順を説明した。また、興味のあるウイルスが容易に識別できるプラークを生成しない場合は、希望するバリアントはpurif可能性があります限界希釈法によってIED。このアプローチは、本質的にウイルスストックは、井戸の50％未満が感染しているように希釈して96ウェルフォーマット、のTCID 50です。この希釈を用い、上記と同様のアプローチは、10個の変種まで分離し、そのシーケンスを確認するには、取得されます。前述したように、最善のケースでは、ウイルス株の感染性cDNAクローンは入手可能です。変異体の分離は、このように必要ではないでしょう。我々の経験では、忠実度の亜種は、単一のアミノ酸置換の結果であり、したがってそのようなQuikchange（アジレント）のような単純な、市販の変異導入キットを使用して生成することができます。 secondaryオプションは、密接に関連菌株のcDNAクローンを使用することです。しかし、関連株が使用されている場合、我々は強く我々は2つ​​の密接に関連ウイルスに突然変異を変える同じ忠実度は、必ずしも同じ効果を持っていないことを発見したので、このアプローチとウイルスの分離（例えば、プラーク精製）の両方を使用することをお勧めします。 フィデリティと複製。RNA変異原性物質耐性変異株の選択は、野生型の対応4,12,15に似ている成長の特性を持つ上位と下位忠実バリアントの両方の分離をもたらしました。現在、ポリメラーゼ活性率と忠実度の間のリンクは完全には分かっていない。低忠実度の亜種は、より高速な処理1-3,12を持っている傾向がある一方、in vitroで精製したRNAポリメラーゼを用いて生化学的研究は、より高い忠実度の亜種が遅い処理速度を有することが示されている。組織培養では、これらの違いは、律速段階である、そのリソースの可用性ではなく、内因性ポリメラーゼ活性の動態を示唆し、通常は明らかではありません。忠実度のバリアントは、野生型と有意差はない速度で複製する場合は、それらの変異の頻度の比較を直接行うことができます。レプリケーションの速度で非常に重要な変更が存在する場合、データは複製を同じサイクル数を受けたウイルスを比較することによって、例えば運動の違い、を考慮して正規化する必要があります。ワンステップの成長速度に有意差が野生型と高忠実度の亜種間で観察されなかったものの、我々の経験では、、（内々には、より高い忠実度の亜種が一貫して野生型に比べて（1ログ内の）より高い力価が観察しかし、彼らはわずかにRNAを作る同程度の大きさ）は、さらにそれらが生み出すゲノムが少ない突然変異を含む多くの感染、従ってであることを示唆している。 サンプル調製とシーケンシングは。これらのプロトコルのすべての手順については、それは彼らが生物学的に関連する変異と区別できないので、高忠実度、プルーフリーディング酵素は、さらなる変異を導入制限するためにPCRおよびRT - PCRに使用されることが不可欠です。それは比較されるウイルスの集団は十分な出発材料ができたことを確認することも重要であると同じ条件（流路の歴史、組織培養培地、温度、RNA抽出法、RT - PCRのプロトコル、等）で準備されていることが重要です強力なバンドがRT - PCRによって生成されるように、RNAの抽出から得られる。 RNAサンプルの1 / 100希釈は、試料が（何度も同じゲノムを増幅する）表現のバイアスを避けるために、RNA分子の十分な数字が含まれていることを示す、検出可能なRT - PCRのバンドを与える必要があります。変異頻度がディストリビューションなので、一つは前述のバイアス発生していないを提供し、同様の値に関係なく、人口規模の得られることを期待。図6に示すように、ウイルスストックの10 5倍希釈では、親の株と大幅に異なるがない突然変異の頻度を与えます。 TopoTAクローニングのための最適な条件が見つかるまで、シーケンスの前にコロニーPCRによって、青/白スクリーニング後の挿入の有無を確認する。である（ウイルスのゲノムに対応するのin vitro転写されたRNAの変異ノイズ（RT - PCRおよびシークエンシングによって導入された変異）、プラスミドベアリングから同じウイルス配列をPCR産物をクローンおよび/またはクローンとシーケンスRT - PCR産物のためのコントロールとしてin vitro転写酵素で異なるが）別のエラー率を持っていると、プロシージャの実際のバックグラウンドでエラーに有用な情報を得られない可能性があることに注意。いくつかのウイルスの配列は、バクテリアに有毒かもしれないので、突然変異の頻度のために配列決定されるウイルスゲノムの領域を決定する前にこれを確認することが重要です。 TopoTAによって得られた配列を分析する際に、各クローンは1つだけ挿入/配列を含む必要があることに注意して。ダブルピークが混合集団を示唆し、観察される場合、それは2つの隣接する細菌のコロニーが選択されている可能性があります。非常に低い突然変異は細菌培養におけるプラスミドの増幅の間に導入されたこと、細菌の複製に低い突然変異の周波数を与えられたが、それは、も可能です。プラークpのurified集団、ダブルピークが重なってプラーク、またはプラークの開発中に新たな変異を獲得したり突然変異を戻しているウイルスを表してもよい。一貫性と数えるかどうか、これらの変異をカウントするかどうかを決定します。 最後に、ここで使用される突然変異の頻度は相対値であることに留意してください。彼らは、同じ条件下で栽培したウイルス集団の比較でのみ有効であり、同じ領域に塩基配列を決定！これらは、突然変異率、または全体としてのゲノムの変異頻度の絶対値として解釈されるべきではない。しかし、条件が制御されている場合、それらは、突然変異の分布と周波数の差の再現性、定量的な比較を許可しません。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>リバビリン</td><td>シグマ</td><td> R9644 - 10mgの</td><td></td></tr><tr><td> 5 - フルオロウラシル</td><td>シグマ</td><td> F6627 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> 5 - アザシチジン</td><td>シグマ</td><td> A2385 - 100mgの</td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2の </td><td>シグマ</td><td> M1028 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2を </td><td>シグマ</td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマ</td><td> T8154 - 20mlの</td><td></td></tr><tr><td> TopoTAクローニングキット</td><td>インビトロジェン</td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange変異導入キット</td><td>アジレント</td><td> 200516 </td><td> cDNAの感染性クローンは入手可能である場合</td></tr><tr><td> 96ウェルミニプレップキット</td><td>マシュレ-ナーゲル</td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene、Sequencher </td><td> DNASTAR、ジーンコード株式会社</td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td>または他のアラインメントソフトウェア</td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

RNAウイルスは、自分のゲノムを複製するRNA依存性RNAポリメラーゼを使用してください。これらの酵素の本質的に高いエラー率は、ウイルスの適応と進化を容易に極端な人口の多様性の世代に大きな貢献しています。証拠を増やすと、RNAウイルスの固有誤差率、および結果として得られる変異の頻度は、ウイルスのポリメラーゼに微妙なアミノ酸の変化によって変調することができることを示しています。生化学的アッセイは、定款の忠実度の定量的測定を可能にするいくつかのウイルスRNAポリメラーゼのために存在しますが、ここで我々は忠実変える変異を同定する生化学的なアプローチな限り正確であることが証明されてRNAウイルスの変異の頻度を測定する簡単な方法を説明します。アプローチは、ほとんどの生物学の実験室で行うことができる、従来のウイルス学的およびシーケンシング技術を使用しています。異なるウイルスの数の経験に基づいて、我々は、忠実度の亜種を分離して統計的有意性のデータを生成する可能性を高めるために最適化する必要がある重要な手順を特定している。忠実変える変異の単離および特性は、ポリメラーゼの構造と機能1月3日に新たな洞察を提供することができます。さらに、これらの忠実度の亜種は、ウイルスの適応と進化4-7のメカニズムを特徴付けるのに有用なツールになります。

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

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