Name: isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00
Duration: 18 min 10 s
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Este trabalho foi financiado por fundos da Medicina e Pesquisa em Saúde doação da Cidade de Paris, os franceses Nacional conceder ANR-09-JCJC-0118-1, ea ERC Começando Grant Projeto RNAvirusPopDivNVax não. 242.719.

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	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. 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K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Escolha da linha celular. A eficácia de análogos de base como RNA mutagénicos correlaciona-se com a sua aceitação em relação a diferentes tipos de células 11. Se a linha de células que é normalmente utilizado para a passagem do vírus se mostra refratária à absorção mutagênico ou muito sensíveis (alta toxicidade celular), pode ser necessário usar uma outra linha de células que atenda a esses requisitos e ainda é permissivo para a replicação viral. Uma vez que a variante resistência mutagênico é isolado, o restante da caracterização pode ser realizada no original linha celular, de preferência. Em nossa experiência, as células HeLa absorver a mutagênico; células BHK requerer até 10 vezes maiores concentrações e células Vero são refratários à captação mutagênico. Escolha de mutagênico. Na tentativa de isolar variantes fidelidade por mutagênico tratamento, a probabilidade de sucesso é maior se houver mais de um tipo de mutagênico é usado. Mutagénicos de base analógica de estrutura diferente, que são erroneamente incorporados genomas durante a replicação será predominantemente induzir resultar em um subconjunto específico de mutações nos ciclos de replicação subsequentes: ribavirina favorece GtoA e mutações de transição CtoU 12; 5 azacitidina tem um viés similar, com a Além de CtoG e transversões GtoC 13; 5-fluorouracil, preferencialmente induz transições Atogue e UtoC 14. Alternativamente, maiores concentrações de Mg 2 + ou Mn 2 + pode ser suplementada ao meio para aumentar a freqüência de mutação dos vírus RNA total, sem o viés descrito acima de 12. Dependendo seqüências do vírus códon, e as mudanças códon necessária para gerar uma variante fidelidade, algumas destas condições irá favorecer o surgimento desta variante em detrimento de outros. Para a maior fidelidade G64S poliovírus e vírus Coxsackie A372V, tratamento ribavirina mais prontamente selecionados para as variantes porque a transição Atogue necessários no local códon correspondeu à mutações predominantemente gerado por este ribavirina. MOI tamanho da população vs. Em virologia, protocolos para a infecção por cultura de tecidos prestar especial atenção à multiplicidade de infecção (MOI), para evitar o acúmulo de partículas defeituoso interferente (baixa MOI) ou para promover a recombinação entre os vírus (alta MOI), para exemplo. Selecionar para eventos emergência sobre serial passaging, também é importante considerar o tamanho da população de vírus. Desde o mutante resistente inicialmente existe em baixa freqüência, é melhor transferir tão grande tamanho de uma população possível de uma passagem para a próxima (10 5 -10 6 vírus, por exemplo) para evitar a perda destas variantes emergentes em cada passagem. Ampliação do tamanho do bem ou frasco (número de células infectadas) podem ajudar a minimizar o aumento do MOI se isso é preocupante. Por outro lado, para experimentos em que a sensibilidade de um vírus para mutagênico está sendo testado, infecção MOI baixa é realizada, a fim de aumentar o número de ciclos de replicação que ocorre no experimento e para evitar resgate de genomas mutagenizados por genomas maior aptidão através de complementação em co-células infectadas. Isso é importante porque as mutações no genoma da progênie gerada durante a primeira rodada de replicação não será imediatamente detectada. A maioria destes RNAs mutagenizados ainda serão embalados em virion. É na próxima rodada de infecção que as mutações letais presentes nestes genomas resultará em um ciclo de replicação abortada, e redução do título de vírus. Pode ser necessário para permitir várias rodadas de acumulação de mutações antes de um efeito significativo da mutagênese letal é observado. Finalmente, se ao longo da série passagem na presença de agentes mutagénicos, os títulos de vírus continue a cair até a extinção, em seguida, o pesquisador deve tentar passaging vírus gradualmente crescentes quantidades de mutagênico (a partir de uma concentração muito baixa). Mutagénicos isolamento e geração do clone mutagênico RNA resistentes da população RNA mutagênico-resistente. RNA introduzir múltiplas mutações aleatórias para cada genoma, mas a seleção para resistência só irá enriquecer (e corrigir a seqüência de consenso) a mutação de resistência. Para identificar esta mutação, a sequência de população resistente mutagênico (consenso da população) e não vírus individual. Assim, o único, mutações aleatórias criadas pelo mutagênico não são detectados na seqüência, apenas as mutações que resultam em mudanças consenso após a seleção, são encontrados. Em nossa experiência, identificam apenas uma ou duas alterações na seqüência de tal consenso. Uma vez que a população resistente mutagênico é obtida e a mutação de resistência é identificada, é necessário para gerar um estoque de mais puro desta variante. Acima, descrevemos um procedimento de purificação de placa. Alternativamente, se o vírus de interesse não produz placas facilmente identificáveis, a variante desejada pode ser Purified limitando diluição. Esta abordagem é, essencialmente, a 50 TCID em formato de 96 poços, onde o estoque de vírus é diluído de tal forma que menos de 50% dos poços estão infectados. Usando esta diluição, a mesma abordagem que acima foi tirado, de isolar até 10 variantes individuais e confirmando suas seqüências. Como mencionado, no melhor dos casos, um clone infeccioso de cDNA da cepa do vírus está disponível. Isolamento da variante seria, portanto, não ser necessário. Em nossa experiência, fidelidade variantes são o resultado de um único substituições de aminoácidos e pode assim ser gerados usando simples, kits mutagênese comercializado como Quikchange (Agilent). A opção secundária é a utilização de um clone de cDNA de uma cepa intimamente relacionados. No entanto, se uma cepa relacionada é usado, nós sugerimos usando tanto a abordagem deste e isolamento do vírus (purificação de placa, por exemplo) porque descobriram que a mutação mesma fidelidade alterando em dois vírus estreitamente relacionados não vai necessariamente ter o mesmo efeito. Fidelidade e Seleção de replicação. Variantes de RNA mutagênico resistentes resultaram no isolamento de ambas as variantes de maior e menor fidelidade com características de crescimento que são semelhantes aos seus homólogos do tipo selvagem 4,12,15. Atualmente, a ligação entre as taxas de atividade da polimerase e fidelidade não é totalmente compreendido. In vitro estudos bioquímicos utilizando purificada RNA polimerase têm demonstrado que as variantes com maior fidelidade têm taxas de processamento mais lento, enquanto variantes menor fidelidade tendem a ter um processamento mais rápido 1-3,12. Em cultura de tecidos, essas diferenças geralmente não são evidentes, sugerindo que a disponibilidade de recursos, ao invés de cinética de atividade intrínseca da polimerase, é o passo limitante. Se a variante fidelidade repetições, com cinética de que não são significativamente diferentes de tipo selvagem, em seguida, uma comparação de suas freqüências de mutação pode ser feita diretamente. Se uma mudança muito significativa na cinética de replicação existe, então os dados devem ser normalizados para explicar as diferenças cinética, por exemplo, comparando vírus que sofreram o mesmo número de ciclos de replicação. Em nossa experiência, embora nenhuma diferença significativa em uma etapa cinética de crescimento foram observadas entre o tipo selvagem e variantes de alta fidelidade, observou-se que as variantes com maior fidelidade consistentemente mais elevada titulação (dentro de um log) em relação ao tipo selvagem, mas eles fazem um pouco menos RNA (dentro da mesma ordem de magnitude), sugerindo ainda que os genomas que contêm produzir mutações menos e são, portanto, mais infeccioso. Preparação de amostras e seqüenciamento. Para todos os passos nestes protocolos, é imperativo que a alta-fidelidade, uma prova de leitura de enzimas são utilizadas para PCR e RT-PCR para limitar a introdução de mutações adicionais, uma vez que não pode ser distinguido de mutações biologicamente relevantes. É fundamental que as populações de vírus a serem comparados foram preparadas nas mesmas condições (história passagem, meio de cultura de tecidos, a temperatura, método de extração de RNA, RT-PCR protocolos, etc) Também é importante assegurar que o material de partida foi o suficiente obtidos a partir da extração de RNA de modo que uma banda forte é gerada por RT-PCR. A diluição de 1 / 100 da amostra de RNA também deve dar uma banda de RT-PCR detectável, indicando que a amostra contém um número suficiente de moléculas de RNA para evitar viés de representação (amplificação do genoma do mesmo repetidamente). Desde frequência de mutação é uma distribuição, seria de esperar que os valores semelhantes poderão ser obtidas independentemente do tamanho da população, desde o viés referido não está ocorrendo. Como a Figura 6 mostra, a 10 de diluição de 5 vezes de um estoque de vírus dá uma frequência de mutação que não é significativamente diferente do estoque parental. Até que as condições ideais para TopoTA clonagem são encontradas, confirmar a presença de inserções após triagem azul / branco, por colônia PCR antes de seqüenciamento. Como um controle para o ruído de mutação (mutações introduzidas por RT-PCR e sequenciamento), clone de um produto PCR de um rolamento plasmídeo a sequência viral mesmo e / ou clone e seqüência RT-PCR em produtos de RNA transcrito vitro correspondente ao genoma do vírus (seja ciente de que diferentes enzimas de transcrição in vitro têm taxas de erro diferentes e não podem dar informações úteis como para o erro de fundo de verdade em seu procedimento). Algumas seqüências de vírus podem ser tóxica para bactérias, por isso, é importante verificar isso antes de decidir sobre a região do genoma viral a ser sequenciado para a freqüência de mutação. Na análise de seqüências obtidas pelos TopoTA, note que cada clone deve conter apenas inserir um / seqüência. Se um pico duplo é observada, sugerindo uma população mista, é possível que dois vizinhos colônias bacterianas foram selecionados. Também é possível, embora improvável, dada a baixa freqüência de mutação na replicação bacteriana, que a mutação foi introduzida durante a amplificação do plasmídeo na cultura bacteriana. Na placa purified populações, um pico duplo pode representar placas sobrepostas, ou um vírus que está adquirindo uma nova mutação ou reverter uma mutação durante o desenvolvimento da placa. Ser consistente e decidir sobre a contar ou não contar estas mutações. Finalmente, tenha em mente que as freqüências de mutação usadas aqui são valores relativos. Eles são válidos apenas para comparar populações de vírus cultivadas sob a mesma condição, e seqüenciado sobre a mesma região! Eles não devem ser tomados como valores absolutos da taxa de mutação, ou a freqüência de mutação do genoma como um todo. No entanto, quando as condições são controladas, permitem realmente reprodutível, comparações quantitativas de diferenças na distribuição de mutação e de freqüência.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> ribavirina </td><td> Sigma </td><td> R9644-10mg </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacitidina </td><td> Sigma </td><td> A2385-100mg </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de tripano </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA clonagem kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange mutagênese kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Se um clone de cDNA infeccioso está disponível </td></tr><tr><td> De 96 poços miniprep kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporação </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Ou software de alinhamento outras </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Vírus RNA polimerase RNA dependente utilizar RNA para replicar os seus genomas. A taxa de erro intrinsecamente alta destas enzimas é um grande contribuinte para a geração de diversidade populacional extrema que facilita a adaptação e evolução do vírus. Crescente evidência mostra que as taxas de erro intrínseco, e as freqüências de mutação resultante, de vírus de RNA pode ser modulada por sutis mudanças de aminoácidos para a polimerase viral. Embora ensaios bioquímicos existem por algum polimerases RNA viral que permitem a medida quantitativa da incorporação fidelidade, aqui nós descrevemos um método simples de medir freqüências de mutação de vírus de RNA, que provou ser tão precisos como abordagens bioquímicas na identificação de mutações alterando a fidelidade. A abordagem utiliza técnicas convencionais de virológica e seqüenciamento que podem ser executadas na maioria dos laboratórios de biologia. Com base em nossa experiência com uma série de vírus diferentes, identificamos os principais passos que devem ser otimizado para aumentar a probabilidade de isolar variantes fidelidade e gerar dados de significância estatística. O isolamento e caracterização de mutações alterando a fidelidade pode fornecer novos insights sobre a estrutura e função da polimerase 1-3. Além disso, essas variantes fidelidade podem ser ferramentas úteis na caracterização de mecanismos de adaptação do vírus ea evolução 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

O presente artigo descreve os passos necessários para isolar e caracterizar variantes RNA polimerase fidelidade de vírus RNA e como usar dados de freqüência de mutação para confirmar as alterações fidelidade em cultura de tecidos.

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