Name: isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00
Duration: 18 min 10 s
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Este trabajo fue apoyado por fondos de la Medicina y la Investigación en Salud de subvención de la Ciudad de París, la Nacional de Francia conceder ANR-09-JCJC-0118-1, y el ERC Starting Grants del proyecto RNAvirusPopDivNVax no. 242719.

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	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. 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Elección de la línea celular. La eficacia de los análogos de base como ARN mutágenos se correlaciona con la captación relativa de diferentes tipos de células 11. Si la línea celular que normalmente se utiliza para el paso de virus ha demostrado ser resistente a la absorción de mutágeno o demasiado sensible (alta toxicidad celular), puede ser necesario el uso de otra línea celular que cumpla con estos requisitos y sigue siendo permisiva para la replicación viral. Una vez que la variante de la resistencia mutágeno es aislado, el resto de la caracterización se puede realizar en la línea original, de celda preferida. En nuestra experiencia, las células HeLa tome fácilmente el mutágeno; células BHK requerir hasta 10 veces las concentraciones más altas y las células Vero son refractarios a la captación de mutágeno. Elección de mutágeno. Al tratar de aislar variantes fidelidad por el tratamiento mutagénico, la probabilidad de éxito aumenta si hay más de un tipo de mutágeno se utiliza. Mutágenos analógicas de estructura diferente, que son erróneamente incorporado en el genoma durante la replicación predominantemente inducirá resultar en un subconjunto específico de mutaciones en los ciclos de replicación posterior: el tratamiento con ribavirina favorece GtoA y mutaciones CtoU de transición de 12, 5-azacitidina tiene una tendencia similar, con la Además de CtoG y transversiones GtoC 13, 5-fluorouracilo preferentemente induce transiciones Atog y UtoC 14. Por otra parte, la mayor concentración de Mg 2 + o Mn 2 + se puede complementar con el medio para aumentar la frecuencia de mutación de los virus ARN total sin el sesgo se ha descrito anteriormente 12. En función de las secuencias de codones del virus, y los cambios codón necesaria para generar una variante de la fidelidad, algunas de estas condiciones favorecen la aparición de esta variante respecto a otros. Para la mayor fidelidad G64S poliovirus y el virus Coxsackie A372V, el tratamiento con ribavirina más fácilmente seleccionados para las variantes debido a la transición Atog requerido en el sitio codón corresponde a las mutaciones sobre todo generada por este ribavirina. MOI vs tamaño de la población. En la virología, los protocolos para la infección por el cultivo de tejidos preste especial atención a la multiplicidad de infección (MOI), para evitar la acumulación de partículas defectivas interferentes (MOI baja) o para promover la recombinación entre el virus (de alto MOI), para ejemplo. Para seleccionar los eventos aparición en serie de pases, también es importante tener en cuenta el tamaño de la población de virus. Desde el mutante resistente inicialmente existe en baja frecuencia, lo mejor es la transferencia de tan gran tamaño de la población como sea posible de un pasaje a la siguiente (10 5 -10 6 virus, por ejemplo) para evitar la pérdida de estas variantes emergentes en cada paso. Ampliar el tamaño del pozo o frasco (número de células infectadas) puede ayudar a minimizar el aumento de MOI, si esto es motivo de preocupación. Por otro lado, para los experimentos en que se la sensibilidad de un virus mutágeno a prueba, la infección MOI baja se realiza con el fin de aumentar el número de ciclos de replicación que ocurren en el experimento y para evitar rescate de los genomas de mutagénesis por los genomas mayor aptitud a través de complementación en cooperación con las células infectadas. Esto es importante porque las mutaciones generadas en los genomas de la progenie durante la primera ronda de replicación no se detectan inmediatamente. La mayoría de estos RNAs mutagenizadas todavía se empaquetan en viriones. Es en la siguiente ronda de la infección que las mutaciones letales presentes en estos genomas se traducirá en un ciclo de replicación abortados, y la reducción en el título de virus. Puede que sea necesario para permitir que varias rondas de acumulación de mutaciones antes de que un efecto significativo de la mutagénesis letal se observa. Por último, si más de la serie de pasaje en la presencia de mutágenos, los títulos de virus siguen bajando hasta la extinción, el investigador debe tratar de pases del virus en forma gradual las cantidades crecientes de mutágeno (a partir de una concentración muy baja). El aislamiento y la generación de la copia del ARN mutágeno resistente a partir del ARN mutágeno resistente a la población. Mutágenos ARN presentar múltiples mutaciones al azar para cada genoma, pero la selección de resistencia sólo se enriquecen (y fijar la secuencia consenso) la mutación de resistencia. Para identificar esta mutación, la secuencia de la población resistente mutágeno (consenso de la población) y los virus no individual. Por lo tanto, las mutaciones individuales, aleatoria creada por el mutágeno no se detectan en la secuencia, sólo las mutaciones que dan lugar a cambios en el consenso tras la selección, se encuentran. En nuestra experiencia, sólo identificar a uno o dos cambios secuencia de consenso. Una vez que la población resistente mutágeno se obtiene y la mutación de resistencia es identificado, es necesario generar una acción más pura de esta variante. Anteriormente, se describe un procedimiento de purificación en placa. Por otra parte, si el virus de interés no produce placas fácilmente identificables, la variante deseada puede ser PurifIED por dilución límite. Este enfoque es esencialmente un TCID 50 en formato de 96 pocillos, donde se diluye el stock de virus de manera que menos del 50% de los pozos están infectadas. El uso de este dilución, el mismo enfoque que el anterior se toma, en el aislamiento de hasta 10 variantes individuales y confirmar sus secuencias. Como se ha mencionado, en el mejor de los casos, un clon infeccioso de cDNA de la cepa del virus está disponible. El aislamiento de la variante tanto, no sería necesario. En nuestra experiencia, las variantes de la fidelidad son el resultado de un solo sustituciones de aminoácidos y por lo tanto se pueden generar utilizando kits simple, mutagénesis comercializado como QuikChange (Agilent). Una opción secundaria es el uso de un clon de ADNc de una cepa estrechamente relacionados. Sin embargo, si una cepa relacionada se utiliza, le recomendamos que emplee tanto este enfoque y el aislamiento del virus (por ejemplo, purificación en placa), ya que hemos encontrado que la misma mutación altera la fidelidad de dos virus estrechamente relacionados, no necesariamente tendrá el mismo efecto. La fidelidad y la replicación. Selección de ARN variantes resistentes mutágeno han dado como resultado el aislamiento de los mayores y menores las variantes de la fidelidad con características de crecimiento que son similares a sus homólogos de tipo salvaje 4,12,15. En la actualidad, la relación entre las tasas de actividad de la polimerasa y la fidelidad no se entiende completamente. Los estudios in vitro bioquímicos utilizando ARN polimerasa purificada han demostrado que el aumento de las variantes de la fidelidad tiene un ritmo más lento de procesamiento, mientras que la menor fidelidad variantes tienden a tener un procesamiento más rápido 1-3,12. En cultivo de tejidos, estas diferencias no son evidentes, lo que sugiere que la disponibilidad de recursos, en lugar de la cinética intrínseca de la actividad de la polimerasa, es el paso limitante. Si la variante de la fidelidad se replica con una cinética que no son significativamente diferentes de tipo salvaje, y luego una comparación de sus frecuencias de mutación puede ser hecho directamente. Si un cambio muy significativo en la cinética de replicación en vigor, los datos deben ser normalizados para dar cuenta de las diferencias cinética, por ejemplo mediante la comparación de los virus que han sufrido el mismo número de ciclos de replicación. En nuestra experiencia, aunque no hubo diferencias significativas en un solo paso cinética de crecimiento se observaron entre los de tipo natural y de alta fidelidad de las variantes, se observó que el aumento de las variantes de la fidelidad constante título más alto (a menos de 1 log) en comparación con el tipo salvaje, pero que hacen un poco menos de ARN (dentro de el mismo orden de magnitud), lo que sugiere que el genoma que producen contienen menos mutaciones y, por tanto, más infeccioso. Preparación de la muestra y la secuencia. Para todos los pasos de estos protocolos, es imperativo que los de alta fidelidad, corrección de pruebas, las enzimas se utilizan para la PCR y RT-PCR para limitar la introducción de mutaciones adicionales, ya que no se puede distinguir de las mutaciones biológicamente relevantes. Es fundamental que las poblaciones de virus para ser comparados han sido preparados en las mismas condiciones (el número de pases, medio de cultivo de tejidos, la temperatura, el método de extracción de RNA, RT-PCR protocolos, etc) También es importante asegurarse de que suficiente material de partida fue obtenido de la extracción de RNA de tal manera que una fuerte banda es generado por RT-PCR. Una dilución 1 / 100 de la muestra de ARN también debe dar una detectable por RT-PCR banda, lo que indica que la muestra contiene un número suficiente de moléculas de ARN para evitar el sesgo de representación (amplificación del genoma del mismo en varias ocasiones). Dado que la frecuencia de mutación es una distribución, es de esperar que los mismos valores se obtendrán independientemente del tamaño de la población, siempre que el sesgo mencionado no está ocurriendo. Como muestra la Figura 6 muestra, a 10 5 veces la dilución de un stock de virus ofrece una frecuencia de mutación que no es significativamente diferente de la población reproductora. Hasta que las condiciones óptimas para TopoTA clonación se encuentran, confirmar la presencia de inserciones después de la evaluación azul / blanco, por PCR colonia antes de la secuenciación. Como control de ruido de mutación (mutaciones introducidas por la RT-PCR y secuenciación), clonar un producto de PCR de un plásmido teniendo la misma secuencia viral y / o la clonación de la secuencia y los productos de RT-PCR in vitro de ARN transcrito correspondiente al genoma del virus (se conscientes de que diferentes enzimas de transcripción in vitro tienen diferentes tasas de error y no puede dar información útil sobre el error de fondo real en el procedimiento). Algunas secuencias de virus pueden ser tóxicos para las bacterias, por lo que es importante verificar esto antes de decidir sobre la región del genoma viral para ser secuenciados para la frecuencia de mutación. En el análisis de secuencias obtenidas por TopoTA, tenga en cuenta que cada clon debe contener un solo insertar / secuencia. Si un pico doble, lo cual sugiere una población mixta, es posible que dos colonias de bacterias vecinos fueron seleccionados. También es posible, aunque muy poco probable dada la baja las frecuencias de mutación en la replicación bacteriana, que la mutación se presentó durante la amplificación del plásmido en el cultivo de bacterias. En la placa purified poblaciones, un doble pico puede representar placas superpuestas, o un virus que está adquiriendo una nueva mutación o la reversión de una mutación durante el desarrollo de la placa. Sea consistente y decidir sobre la conveniencia de contar o no contar con estas mutaciones. Por último, tenga en cuenta que las frecuencias de mutación utilizados aquí son valores relativos. Sólo son válidas en la comparación de las poblaciones de virus cultivados en las mismas condiciones, y la secuencia en la misma región! No deben tomarse como valores absolutos de la tasa de mutación, o la frecuencia de mutación del genoma en su conjunto. Sin embargo, cuando las condiciones son controladas, es posible hacer comparaciones reproducible y cuantitativa de las diferencias en la distribución y la frecuencia de mutación.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> ribavirina </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracilo </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacitidina </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100 ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> El azul tripán </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA kit de clonación </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> QuikChange kit de mutagénesis </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Si un clon infeccioso de cDNA está disponible </td></tr><tr><td> 96 y kit minipreparación </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> O el software de alineación de otros </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Uso de los virus de ARN polimerasas de ARN dependiente de ARN para replicar su genoma. La tasa de error intrínsecamente alta de estas enzimas es un gran contribuyente a la generación de diversidad de la población extremo que facilita la adaptación y la evolución del virus. Cada vez más evidencia muestra que las tasas de error intrínseco, y las frecuencias de mutación resultante, de los virus de ARN puede ser modulada por sutiles cambios en los aminoácidos de la polimerasa viral. Aunque existen ensayos bioquímicos para algunos ARN polimerasa viral que permiten medición cuantitativa de la incorporación de la fidelidad, aquí se describe un método simple de medir las frecuencias de mutación de los virus de ARN que ha demostrado ser tan exactos como los enfoques bioquímicos en la identificación de mutaciones alteran la fidelidad. El enfoque utiliza técnicas convencionales virológica y la secuencia que se pueden realizar en los laboratorios de la mayoría de la biología. Basándonos en nuestra experiencia con una serie de virus diferentes, se han identificado los principales pasos que se deben optimizar para aumentar la probabilidad de aislar variantes fidelidad y la generación de datos de significación estadística. El aislamiento y caracterización de las mutaciones alteran la fidelidad puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la estructura y la función de la polimerasa 1-3. Además, estas variantes de la fidelidad pueden ser herramientas útiles en la caracterización de los mecanismos de adaptación del virus y la evolución de 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

El presente artículo describe los pasos necesarios para aislar y caracterizar las variantes de ARN polimerasa fidelidad de los virus de ARN, y cómo utilizar los datos de frecuencia de mutación para confirmar los cambios en la fidelidad de cultivo de tejidos.

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