Name: development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery at JoVE.com

Wij danken Britta Hoehn, Guihua zon, Harris Soifer en Lisa Scherer voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health AI29329 en HL07470 uitgereikt aan de volgende reagentia JJR werden verkregen door het NIH AIDS-onderzoek en referentiereagens Program, Division van aids, NIAID, NIH: De CHO-EE en CHO-cel GP160 lijn, de pNL4-3 luc vector; HIV-1-BAL gp120 uit dan DAIDS, NIAID.

1. Voorbereiding van de RNA-bibliotheek <ol><li> Het uitgangspunt DNA-bibliotheek bevatte 50 nucleotiden van willekeurige sequenties en werd gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). De enkelstrengs DNA-oligo-bibliotheek sequentie is 5&#39;-GGG AGG ACG ATG CGG - N 50 - CAG ACG ACT CGC CCG A - 3 &#39;(81 nt). De willekeurige regio wordt geflankeerd door een constante regio&#39;s, die de T7 promoter voor in vitro transcriptie en een 3 &quot;-tag voor RT-PCR op te nemen. De ...

<ol>
	<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li><li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA.">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li><li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SELEX+primer.">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li><li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type,+secreted,+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein.">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li><li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses.">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li><li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection,+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells.">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+biology+of+aptamers.">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li><li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology,+diagnostics,+and+therapy.">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li><li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+mediated+siRNA+delivery.">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li><li>McNamara, J. O., 2nd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras.">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li><li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors.">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li><li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers.">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li><li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy.">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li></ol>

Aptameren zijn in vitro ontwikkelde nucleïnezuren die specifieke en stabiele drie-dimensionale vormen aannemen, waardoor een uiterst specifieke, sterke binding gerichte moleculen 8. De lage nanomolaire bindingsaffiniteit en specificiteit van exquise aptameren om hun doelstellingen maken veelzijdige tools voor diagnose, in vivo beeldvorming, en therapeutica 9. Met de komst van aptameer technologie voor gerichte siRNA levering is het nu mogelijk om de aptameer bindende functie voor...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> MF-Millipore membraanfilter </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Poriegrootte 0,45 pm </td></tr><tr><td> Swinnex Filterhouder </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm diameter </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> DNA-zuivering </td></tr><tr><td> Microcontroller YM-30 kolom </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA-concentratie </td></tr><tr><td> Bio-spin 30 column </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA-zuivering </td></tr><tr><td> Taq PCR DNA-polymerase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR-systeem </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 transcriptie Kit </td><td> Epicentrum </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP voor PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleïnezuur, transfer van E. coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA concurrent </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L eiwit gp120 </td><td> de AIDS-onderzoek en referentiereagens Programma </td><td> 4961 </td><td> Doelwiteiwit </td></tr><tr><td> Silencer siRNA labeling kit - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Zuur fenol / chloroform 5 / 1-oplossing (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform / isopropanol 24 / 1-oplossing </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Kalf intestinale fosfatase (CIP) </td><td> New England BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 polynucleotide kinase </td><td> New England BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glycogeen </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA neerslag </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biomedische </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:1 </td><td> Nationale Diagnostics </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nationale Diagnostics </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfaat (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat oplossing, 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM niet-essentieel aminozuur (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA klonering kit met pCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery

De wereldwijde epidemie van een infectie met HIV heeft een dringende behoefte aan nieuwe klassen van antiretrovirale middelen. Het krachtige vermogen van kleine storende (si) RNA&#39;s om de expressie van complementaire RNA-transcripten te remmen wordt benut als een nieuwe klasse van geneesmiddelen voor een verscheidenheid van ziekten, waaronder HIV. Vele eerdere rapporten is gebleken dat nieuwe RNAi-gebaseerde anti-HIV/AIDS therapeutische strategieën aanzienlijk belofte hebben, maar een belangrijke belemmering voor de succesvolle therapeutische toepassing en de klinische vertaling van siRNA&#39;s is een efficiënte levering. In het bijzonder, gelet op de veiligheid en werkzaamheid van RNAi-gebaseerde therapieën, is het zeer wenselijk om de ontwikkeling van een gerichte intracellulaire siRNA levering benadering van specifieke cel populaties of weefsels. De HIV-1 eiwit gp120, een glycoproteïne envelop op het oppervlak van HIV-1, speelt een belangrijke rol bij het binnendringen van het virus in de CD4-cellen. De interactie tussen gp120 en CD4-triggers die HIV-1 entry en start celfusie is gevalideerd als een klinisch relevant anti-virale strategie voor drug discovery. Hierin bespreken we eerst de selectie en de identificatie van 2&#39;-F gewijzigd anti-HIV-RNA gp120 aptameren. Met behulp van een conventionele nitrocellulosefilter SELEX methode, werden verschillende nieuwe aptameren met nanomolaire affiniteit geïsoleerd uit een 50 willekeurige nt RNA bibliotheek. Om met succes gebonden soorten te verkrijgen met een hogere affiniteit, is de selectie streng zorgvuldig gecontroleerd door het aanpassen van de voorwaarden. De geselecteerde aptameren kan specifiek binden en worden snel geïnternaliseerd in cellen die het HIV-1 envelop eiwit. Daarnaast kan de aptameren alleen neutraliseren HIV-1 besmettelijkheid. Op basis van de best aptameer A-1, creëren we ook een nieuw, tweevoudig remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera waarin zowel de aptameer en de siRNA porties zijn krachtige anti-HIV-activiteiten. Verder maken we gebruik van de gp120 aptameer-siRNA hersenschimmen voor cel-type specifieke levering van de siRNA in HIV-1 geïnfecteerde cellen. Deze dubbele functie chimera laat zien grote mogelijkheden voor het combineren van verschillende nucleïnezuur therapeutische middelen (aptameer en siRNA) bij het onderdrukken van HIV-1-infectie, waardoor de aptameer-siRNA hersenschimmen aantrekkelijke therapeutische kandidaten voor patiënten bij zeer actieve antiretrovirale therapie (HAART).

Watch this Scientific Journal Video about Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery at JoVE.com

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Verschillende 2&#39;-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek door<em&gt; In vitro</em&gt; SELEX procedure. Een nieuwe dual remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera is gemaakt en toont grote belofte voor de systemische anti-HIV therapie.

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; En andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Ontwikkeling van een Economische DNA Delivery System door &quot;Acufection&quot; en de toepassing ervan op Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...