Name: development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00
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Agradecemos a Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer e Lisa Scherer para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e AI29329 HL07470 concedido a JJR Os seguintes reagentes foram obtidos através da AIDS NIH Programa de Pesquisa e de reagente de referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH: O CHO-EE e CHO-gp160 celular linha, a pNL4-3 luc vetor; HIV-1 BaL gp120 de DAIDS, NIAID.

1. Preparação da biblioteca de RNA <ol><li> A biblioteca de DNA a partir continha 50 nucleotídeos das seqüências aleatórias e foi sintetizada pelo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). O DNA de fita simples seqüência biblioteca oligo é 5&#39;-GGG AGG ATG ACG CGG - N 50 - CAG CGC CCG ACG ACT A - 3 &#39;(81 nt). A região aleatória é flanqueado por regiões constantes, que incluem o promotor T7 para transcrição in vitro e um 3 tag &#39;para RT-PCR. A 5 &#39;e 3&#39; se...

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	<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li><li>Robertson, D. L., Joyce, G. 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Aptâmeros são in vitro evoluiu ácidos nucléicos que assumem específica e estável formas tridimensionais, proporcionando assim altamente específico, forte ligação às moléculas alvo 8. A afinidade nanomolar baixa ligação e especificidade requintado de aptâmeros a seus alvos torná-los ferramentas versáteis para diagnóstico, in vivo de imagem e terapêutica 9. Com o advento da tecnologia aptamer para entrega siRNA alvo agora é possível usar a função de li...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> MF-Millipore filtro de membrana </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Tamanho dos poros 0,45 mM </td></tr><tr><td> Swinnex titular Filtro </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> Purificação de DNA </td></tr><tr><td> Microcontrolador YM-30 coluna </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> Concentração de RNA </td></tr><tr><td> Bio-spin coluna 30 </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> Purificação de RNA </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase PCR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 Kit transcrição </td><td> Epicentro </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP para PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ribonucléico, transferência de E.coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> concorrente tRNA </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L proteína gp120 </td><td> a Pesquisa da AIDS e do Programa de reagente de referência </td><td> 4961 </td><td> Proteína alvo </td></tr><tr><td> Silencer kit rotulagem siRNA - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fenol / clorofórmio 01/05 solução (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio / isopropanol 24 / 1 solução </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Bezerro de fosfatase intestinal (CIP) </td><td> New England BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> Quinase T4 polinucleotídeo </td><td> New England BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glicogênio </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA precipitação </td></tr><tr><td> Gamma-P de 32 ATP </td><td> MP Biomédica </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> Nacional Diagnostics </td><td> CE-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nacional Diagnostics </td><td> CE-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;tetrametiletilenodiamina (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Persulfato de amônio (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Mídia 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de bicarbonato de sódio, 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Meio Essencial Mínimo (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM ácido não-aminoácidos essenciais (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA cloning kit com pCR 2,1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

development of cell-type specific anti-hiv gp120 aptamers for sirna delivery

A epidemia global de infecção por HIV criou uma necessidade urgente de novas classes de agentes anti-retrovirais. A potente capacidade da pequena interferência (si) RNA para inibir a expressão de transcritos complementares RNA está sendo explorado como uma nova classe de tratamentos para uma variedade de doenças incluindo o HIV. Muitos relatórios anteriores mostraram que o romance baseado em RNAi anti-HIV/AIDS estratégias terapêuticas têm a promessa considerável, no entanto, um obstáculo chave para o êxito da aplicação terapêutica e tradução clínica de siRNAs é a entrega eficiente. Particularmente, considerando a segurança e eficácia de terapias baseadas em RNAi, é altamente desejável desenvolver uma abordagem de entrega prevista intracelular siRNA para populações de células ou tecidos específicos. O HIV-1 proteína gp120, uma glicoproteína do envelope na superfície do HIV-1, desempenha um papel importante na entrada do vírus nas células CD4. A interação de gp120 e CD4 que desencadeia HIV-1 de entrada e inicia a fusão celular foi validado como clinicamente relevante estratégia anti-viral para a descoberta de drogas. Aqui, nós em primeiro lugar discutir a seleção e identificação de 2&#39;-F modificado anti-HIV gp120 aptâmeros RNA. Utilizando um método convencional SELEX nitrocelulose filtro, várias aptâmeros novo com afinidade nanomolar foram isolados a partir de 50 nt RNA aleatórias biblioteca. A fim de conseguir obter espécies presos com maior afinidade, o rigor de seleção é cuidadosamente controlado, ajustando as condições. O aptâmeros selecionados podem se ligam especificamente e ser rapidamente internalizado nas células expressando a proteína do HIV-1 envelope. Além disso, o aptâmeros sozinho pode neutralizar o HIV-1 infectividade. Com base no melhor aptamer A-1, também criamos um romance dupla função inibitória anti-gp120 aptamer siRNA-quimera em que ambos os aptamer e as porções siRNA têm potentes atividades anti-HIV. Além disso, nós utilizamos a gp120 aptamer siRNA-quimeras para a célula do tipo de entrega específico do siRNA para HIV-1 células infectadas. Esta dupla função quimera mostra um potencial considerável para a combinação de vários agentes terapêuticos de ácido nucléico (aptamer e siRNA) na infecção por HIV-1 suprimindo, tornando-as quimeras aptamer siRNA atraente candidatos terapêuticos para pacientes com falha terapêutica anti-retroviral altamente ativa (HAART).

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Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Vários aptâmeros 2&#39;Fluoro-RNA contra o HIV-1BA-L gp120 com nanomole afinidade são isolados de uma biblioteca por RNA<em&gt; In vitro</em&gt; Processo de SELEX. A nova dupla função inibitória anti-gp120 aptamer siRNA-quimera é criado e mostra a promessa considerável para a terapia anti-HIV sistêmica.

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Desenvolvimento de um marcador negativo selecionáveis ​​para Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

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A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

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Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

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A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga

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Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

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Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

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Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; E outro<em&gt; Vibrio</em&gt; Espécies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

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Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

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