Name: efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation at JoVE.com

De auteurs willen graag Eva Hadzimova, Pierre Mattar en Christopher Kovach bedanken voor hun eerste werk bij het vaststellen van in de baarmoeder elektroporatie technologie in de CS lab. Dit werk werd gefinancierd door een Canadese Institute of Health Research (CIHR) subsidie ​​(MOP 44094) en CIHR / Stichting Fighting Blindness (FFB) Emerging Team Grant (00933-000) om CS en een Alberta Children&#39;s Hospital Research Foundation Grant naar DMK. RD werd ondersteund door een CIHR Canada Hope Scholarship, is RC ondersteund door een FFB studententijd en LML werd ondersteund door een CIHR Training Grant in Genetics and Child Development.

1. Set-up <ol><li> Set-up chirurgische gebied zoals getoond in Fig. 1A, A &#39;. Belangrijke onderdelen van de set-up onder andere een Eppendorf Femtojet microinjector, Narishige micromanipulator met naaldhouder, Leica steromicroscope, glasvezel verlichting, ECM 830 Square Wave Elektroporatie System met elektroden, verwarming pad en een vaporizer voor isofluraan anesthesie. </li><li> Reinig alle gereedschappen met een BRANSONIC Ultrasonic Cleaner gebruik Metriclean2 Laagschuimende oplossing voor sonicating chirurgisch...

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236.">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li><li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity.">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries:+implications+for+neuronal+repair.">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li></ol>

In utero elektroporatie kan gebruikt worden om een breed scala van ontwikkelingsprocessen te analyseren. Zo kan bijvoorbeeld transfectie van reporter genen zoals GFP, mCherry of alkalische fosfatase worden gebruikt om de lineage tracing en neuronale migratie experimenten uit te voeren. Als alternatief kan Cre-recombinase tijdelijk worden uitgedrukt om selectief te elimineren een floxed allel in een ruimtelijk-en / of tijdelijk-gecontroleerde manier. Bovendien kan shRNA of dominant negatieve constructies worden ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Categorie </th></tr><tr><td> Fijn schaar </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 14078-10 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Iris schaar, gebogen </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 14061-10 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicate naaldhouder </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 12002-12 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Ring tang, 9mm </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 11103-09 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Oog dressing pincet </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 11051-10 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX pincet </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 11271-30 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX pincet </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 11251-30 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Tissue pincet-Adson </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 11027-12 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Reflex Clip Applier </td><td> Wereld precisie-instrument </td><td> 500343 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Geperforeerde Spoon, 15 mm diameter </td><td> Fine Science Tools Inc </td><td> 10370-18 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Silk Black Gevlochten Suture </td><td> Ethicon Inc </td><td> K871 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> Reflex Wondsluiting Stainless Steel Wound Clips </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 500346 </td><td> Chirurgische instrumenten </td></tr><tr><td> ECM 830 Square Wave Elektroporatie System </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Pincet w / Variabele Gap 2 Ronde 5mm Platinum Plate Electrode </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY650P5 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Pincet w / Variabele Gap 2 Ronde 7mm Platinum Plate Electrode </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY650P7 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Eppendorf Femtojet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Foot Control voor Eppendorf Femtojet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> BRANSONIC Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534-CPN 952-118 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipet Puller </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc </td><td> P-97 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Micropipetten - Borosilicaat voor gloeilampen en OD: 1mm, ID: 0,78 mm, 10 cm lengte </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> 3-Axis Grof Manipulator </td><td> Carl Zeiss Canada Inc </td><td> M-152 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Magnetische houder voor micromanipulator </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> M1 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Stalen bodemplaat voor micromanipulator </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 5052 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Micropipet Holder </td><td> Wereld PrESLUIT Instrumenten </td><td> MPH3 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Micropipet Handvat </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 5444 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Stereomicroscoop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Verdamper voor isofluraan anesthesie </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODEL 100-F </td><td> Instrumenten </td></tr><tr><td> Metriclean2 Laagschuimende oplossing voor sonicating chirurgische instrumenten </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Gentamicine 40mg/ml in 0,2 g methyleenblauw antibiotica spuiten na het hechten </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Germex voor het steriliseren van chirurgische instrumenten </td><td> Vetoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> BNP oogzalf </td><td> Vetoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Gedistribueerd door Church &amp; Dwight Co, Inc </td><td> commercieel beschikbaar </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v huid schoner </td><td> Omega Laboratories Inc </td><td> 01938983 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Buprenorfine (Temgesic) pijnstillende </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Sulfonamide &quot;25&quot; sulfamethazine orale antibiotica </td><td> Professionele Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Ringerlactaat </td><td> Baxter Corporation </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Saline - 0,9% natriumchloride </td><td> B-Braun Medical Inc </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Inhalatie - Isofluraan USP </td><td> Farmaceutische Partners van Canada Inc </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Chirurgische Reagentia </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

De mogelijkheid om genexpressie te manipuleren is de hoeksteen van de moderne dag experimentele embryologie, die leidt tot de opheldering van verschillende ontwikkelingstrajecten. Een aantal krachtige en gevestigde transgene technologieën zijn beschikbaar om genexpressie niveaus in muizen te manipuleren, waardoor het genereren van zowel de verlies-en winst-of-function modellen. Echter, de generatie van transgene muis is zowel kostbaar en tijdrovend. Alternatieve methoden van genetische manipulatie zijn dan ook op grote schaal gezocht. In utero elektroporatie is een methode van de genetische levering in levende muis embryo&#39;s 1,2, dat we met succes hebben 3,4 aangepast. Het is grotendeels gebaseerd op het succes van de in-ovo elektroporatie technologieën die vaak worden gebruikt in de kuikens 5. In het kort, is DNA geïnjecteerd in de open ventrikels van de zich ontwikkelende hersenen en de toepassing van een elektrische stroom zorgt ervoor dat de vorming van tijdelijke poriën in celmembranen, waardoor de opname van DNA in de cel. In onze handen, kunnen embryo&#39;s efficiënt worden geëlektroporeerd zo vroeg embryonale dag (E) 11,5, terwijl de doelgerichtheid van de jongere embryo&#39;s zou een echo-geleide microinjectie protocol, zoals eerder beschreven zes vereisen. Omgekeerd, E15.5 is de nieuwste fase kunnen we gemakkelijk electroporate, te wijten aan het begin van de pariëtale en frontale bot-differentiatie, die micro-injectie belemmert in de hersenen. In tegenstelling, het netvlies is toegankelijk via het einde van de embryogenese. Embryo&#39;s kunnen worden verzameld op elk tijdstip gedurende de embryonale of vroege postnatale periode. Injectie van een reporter construct vergemakkelijkt de identificatie van de getransfecteerde cellen. Tot op heden heeft in utero electroporatie het meest grote schaal gebruikt voor de analyse van de neocorticale ontwikkeling 1,2,3,4. Meer recente studies hebben gericht op de embryonale netvlies 7,8,9 en thalamus 10,11,12. Hier presenteren wij een gewijzigd in utero electroporatie protocol dat gemakkelijk kan worden aangepast aan de verschillende domeinen van de embryonale CNS doel. Wij leveren het bewijs dat door het gebruik van deze techniek kunnen we de embryonale telencephalon, diencephalon en netvlies doel. Representatieve resultaten worden gepresenteerd in de eerste tonen van het gebruik van deze techniek om DNA-expressie constructen te introduceren in de laterale ventrikels, waardoor we progenitor rijping, differentiatie en migratie monitor in de embryonale telencephalon. We tonen ook aan dat deze techniek kan worden gebruikt om DNA te richten op de diencephalic gebieden rond de 3 e ventrikel, waardoor de trekroutes van differentiëren neuronen in diencephalic kernen te worden gecontroleerd. Ten slotte hebben we laten zien dat het gebruik van micromanipulators stelt ons in staat om nauwkeurig DNA-constructen te introduceren in kleine doelgebieden, inclusief de subretinale ruimte, waardoor we de effecten van het manipuleren van genexpressie op het netvlies ontwikkeling te analyseren.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation at JoVE.com

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided micro-injectie in de muis voorhersenen In Utero At E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Levering aan Postnatale Rat Brain door niet-ventriculaire Plasmide-injectie en elektroporatie

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generatie Topisch transgene Rats door<em&gt; In de baarmoeder</em&gt; Elektroporatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microchirurgie Infusion Techniek voor gerichte afgifte van een substantie in het centraal zenuwstelsel<i&gt; via</i&gt; De interne halsslagader

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...