Name: efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach per il loro lavoro iniziale per stabilire nella tecnologia di elettroporazione utero in laboratorio CS. Questo lavoro è stato finanziato da una Canadian Institute of Health Research (CIHR) sovvenzioni (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging squadra di Grant (00933-000) per CS e bambini Alberta Hospital Research Foundation Grant a DMK. RD è stato sostenuto da una borsa di studio CIHR Speranza Canada, RC è supportato da un Studentship FFB e LML è stato sostenuto da una borsa di formazione CIHR in Genetica e sviluppo del bambino.

1. Set-up <ol><li> Set-up dell&#39;area chirurgica come mostrato in fig. 1A, A &#39;. I componenti chiave del set-up includono un Eppendorf FemtoJet microinjector, micromanipolatore Narishige con porta aghi, steromicroscope Leica, sistema di illuminazione a fibre ottiche, Piazza del sistema ECM 830 Elettroporazione onda con gli elettrodi, piastra elettrica e un vaporizzatore per isoflurano anestetico. </li><li> Pulire gli attrezzi con un pulitore ad ultrasuoni BRANSONIC utilizzando Metriclean2 soluzione a bassa formaz...

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236.">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li><li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity.">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries:+implications+for+neuronal+repair.">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li></ol>

In utero elettroporazione può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di processi di sviluppo. Per esempio, la trasfezione di geni reporter come GFP, mCherry o della fosfatasi alcalina può essere utilizzato per condurre esperimenti di lineage tracing e migrazione neuronale. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere transitoriamente espresso per eliminare selettivamente un allele floxed in un spazialmente e / o temporalmente modo controllato. Inoltre, shRNA o dominante costruisce negativo può es...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Categoria </th></tr><tr><td> Forbici </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Forbici iris, curva </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicato Porta aghi </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Anello pinze, 9mm </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Occhio spogliatoio Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Tessuto pinza-Adson </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Reflex applicatore clip </td><td> Strumento di precisione mondo </td><td> 500343 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Mestolo forato, 15 mm di diametro </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Di seta nera intrecciata sutura </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Reflex pelle Chiusura in acciaio inossidabile ferita clip </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500346 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> ECM 830 Onda quadra sistema di elettroporazione </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Pinzetta w / Variabile Gap 2 Giornata 5 millimetri elettrodi Piastra Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Pinzetta w / Variabile Gap 2 Giornata 7 millimetri elettrodi Piastra Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Comando a pedale per Eppendorf FemtoJet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> BRANSONIC modello Ultrasonic Cleaner 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995 CPN-534-952-118 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipetta Puller </td><td> Sutter strumento, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipette - borosilicato con filamento OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, 10 cm di lunghezza </td><td> Sutter strumento </td><td> BF100-78-10 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> 3-Axis Manipolatore Coarse </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Tenendo dispositivo magnetico per micromanipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> M1 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Piastra di base in acciaio per micromanipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5052 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipetta Holder </td><td> Pr mondoDECISIONE Instruments </td><td> MPH3 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipetta maniglia </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5444 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Vaporizzatore per anestetici isoflurano </td><td> Porter Strumenti Azienda </td><td> MODELLO 100-F </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Metriclean2 soluzione a bassa formazione di schiuma per sonicating strumenti chirurgici </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml in 0,2 g di blu di metilene spruzzo antibiotica dopo la sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Germex per sterilizzare gli strumenti chirurgici </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> BNP pomata oftalmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuito da Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> disponibili in commercio </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v pelle pulita </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Buprenorfina (Temgesic) analgesico </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Sulfamidici &quot;25&quot; sulphamethazine antibiotico orale </td><td> Professionale Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Ringer lattato soluzione </td><td> Baxter Corporation </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Saline - sodio cloruro 0,9% </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Inalazione anestetico - isoflurano USP </td><td> Partner farmaceutica del Canada Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Verde fast FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

La capacità di manipolare l&#39;espressione genica è la pietra angolare della moderna embriologia giorno sperimentale, che porta alla spiegazione di molteplici vie di sviluppo. Diverse tecnologie potenti e ben consolidata transgenici sono a disposizione per manipolare i livelli di espressione genica nel topo, consentendo la generazione di entrambi perdita e guadagno di funzione dei modelli. Tuttavia, la generazione di topo transgenici è sia costoso e richiede tempo. Metodi alternativi di manipolazione genetica sono stati quindi ampiamente ricercato. In utero elettroporazione è un metodo di consegna del gene in embrioni di topo 1,2 vivere che abbiamo adattato con successo 3,4. È in gran parte sulla base del successo nel campo delle tecnologie di elettroporazione ovo che sono comunemente utilizzati in pulcino 5. In breve, il DNA è iniettato nei ventricoli aperto di sviluppo del cervello e l&#39;applicazione di una corrente elettrica provoca la formazione di pori transienti nelle membrane cellulari, permettendo l&#39;assorbimento del DNA nelle cellule. Nelle nostre mani, gli embrioni possono essere efficacemente elettroporate fin dal giorno embrionale (E) 11,5, mentre l&#39;orientamento dei giovani embrioni richiederebbe un eco-guidata protocollo microiniezione, come descritto in precedenza 6. Al contrario, E15.5 è l&#39;ultima tappa si può facilmente electroporate, a causa della insorgenza di differenziazione dell&#39;osso parietale e frontale, che ostacola microiniezione nel cervello. Al contrario, la retina è accessibile fino alla fine di embriogenesi. Gli embrioni possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento durante il periodo embrionale o postnatale precoce. L&#39;iniezione di un costrutto giornalista facilita l&#39;identificazione delle cellule transfettate. Ad oggi, l&#39;elettroporazione in utero è stata più utilizzata per l&#39;analisi dello sviluppo neocorticale 1,2,3,4. Studi più recenti hanno preso di mira la retina embrionale 7,8,9 e 10,11,12 talamo. Qui vi presentiamo una versione modificata del protocollo di elettroporazione in utero, che può essere facilmente adattato a bersaglio diversi domini del sistema nervoso embrionale. Noi dimostrare che utilizzando questa tecnica, si può avere come bersaglio l&#39;embrionale telencefalo, diencefalo e della retina. Risultati rappresentativi sono presentati, in primo luogo che mostra l&#39;uso di questa tecnica per introdurre costrutti espressione del DNA nei ventricoli laterali, che ci permette di monitorare la maturazione progenitrici, la differenziazione e la migrazione nel telencefalo embrionale. Mostriamo anche che questa tecnica può essere usata per bersaglio del DNA per i territori circostanti diencefalo il 3 ° ventricolo, consentendo le rotte migratorie di differenziarsi in neuroni dei nuclei diencefalo da monitorare. Infine, abbiamo dimostrato che l&#39;uso di micromanipolatori ci permette di introdurre con precisione i costrutti del DNA in aree bersaglio piccolo, incluso lo spazio sottoretinico, che ci permette di analizzare gli effetti della manipolazione dell&#39;espressione genica per lo sviluppo della retina.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation at JoVE.com

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Ricerca

Neuroscienze

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generazione di topi transgenici per uso topico<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione e<em&gt; In vivo</em&gt; Screening bioluminescenza

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale<i&gt; via</i&gt; Carotide interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...