Name: efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach pelo seu trabalho inicial no estabelecimento in utero tecnologia eletroporação no laboratório CS. Este trabalho foi financiado por um Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) conceder (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Equipe Grant (00933-000) para CS e uma crianças de Alberta Hospital Research Foundation Grant para DMK. RD foi apoiado por uma bolsa de estudos Esperança CIHR Canadá, RC é apoiado por um Studentship FFB e LML foi apoiado por uma bolsa de formação CIHR em Genética e Desenvolvimento Infantil.

1. Set-up <ol><li> Set-up área cirúrgica, como mostrado na figura. 1A, A &#39;. Componentes-chave do set-up incluem um Eppendorf FemtoJet microinjetor, Narishige micromanipulador com porta-agulha, steromicroscope Leica, sistema de fibra ótica de iluminação, 830 ECM Sistema de Eletroporação Onda Quadrada com eletrodos, almofada de aquecimento e um vaporizador de anestésico isoflurano. </li><li> Limpe todas as ferramentas com um líquido de limpeza ultra-sônica utilizando Bransonic Metriclean2 solução pouca e...

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	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236.">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li><li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity.">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries:+implications+for+neuronal+repair.">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li></ol>

Eletroporação in utero pode ser usado para analisar uma ampla variedade de processos de desenvolvimento. Por exemplo, a transfecção de genes repórter, como GFP, mCherry ou fosfatase alcalina pode ser usado para conduzir linhagem rastreamento e experiências de migração neuronal. Alternativamente, Cre recombinase pode ser transitoriamente expressa seletivamente eliminar um alelo floxed em um espacialmente e / ou temporalmente controlada maneira. Além disso, shRNA ou dominante constrói negativo pode ser ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Categoria </th></tr><tr><td> Tesoura fina </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Iris tesoura, curvas </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Porta Agulha Ex-Delicate </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Anel de fórceps, 9mm </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Olho vestir Pinça </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Pinça </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Pinça </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Tecidos fórceps-Adson </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Reflex Aplicador Clipe </td><td> Instrumento de precisão mundo </td><td> 500343 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Colher perfurada, 15 mm de diâmetro </td><td> Belas Ciência Ferramentas Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Remover Autoclip </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> De seda preta trançada Suture </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> Reflexo da pele fechamento da ferida inoxidável Aço Clips </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 500346 </td><td> Ferramentas cirúrgicas </td></tr><tr><td> ECM 830 Praça Sistema de Eletroporação Onda </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinças w / Variável Gap Round 2 Eletrodo Placa 5 milímetros Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinças w / Variável Gap Round 2 Eletrodo Placa 7 milímetros Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet microinjetor </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Controle pé para Eppendorf FemtoJet microinjetor </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Modelo Cleaner Bransonic ultra-1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952-118 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipeta Puller </td><td> Sutter Instrumento, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipetas - borosilicato com filamento OD: 1mm, ID: 0,78 mm, 10 cm de comprimento </td><td> Instrumento Sutter </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> 3 Axis-Manipulator Grosso </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Dispositivo de fixação magnética para micromanipulador </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> M1 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Aço Base Plate para micromanipulador </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 5052 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Titular micropipeta </td><td> Pr mundoInstrumentos ECISÃO </td><td> MPH3 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta Handle </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 5444 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Vaporizador de anestésico isoflurano </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODELO 100-F </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Metriclean2 solução pouca espuma para sonicando instrumentos cirúrgicos </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml em 0,2 g de spray azul de metileno de antibióticos após a sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Germex para esterilizar instrumentos cirúrgicos </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> BNP pomada oftálmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuído por Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> comercialmente disponíveis </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Stanhexidine limpador de pele 4% w / v </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Buprenorfina analgésico (Temgesic) </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; de antibióticos orais sulphamethazine </td><td> Professional Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Solução de Ringer com lactato </td><td> Baxter Corporação </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Saline - cloreto de sódio a 0,9% </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Inalação Anestésica - USP isoflurano </td><td> Parceiros farmacêutica do Canadá Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reagentes cirúrgicos </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

A capacidade de manipular a expressão genética é a pedra angular da moderna embriologia experimental dias, levando para a elucidação de múltiplas vias de desenvolvimento. Vários poderosos e bem estabelecida tecnologias transgênicas estão disponíveis para manipular os níveis de expressão gênica no mouse, permitindo a geração de ambos os perda e ganho de função-modelos. No entanto, a geração de transgênicos do mouse é tanto caro e demorado. Métodos alternativos de manipulação genética, portanto, sido amplamente procurado. In utero eletroporação é um método de entrega de genes em embriões de ratos vivem 1,2 que temos adaptado com sucesso 3,4. É em grande parte baseada no sucesso de tecnologias na eletroporação in ovo que são comumente usados ​​em pinto 5. Resumidamente, o DNA é injetado no ventrículos aberta do cérebro em desenvolvimento ea aplicação de uma corrente elétrica provoca a formação de poros transitórios na membrana celular, permitindo a absorção de DNA na célula. Em nossas mãos, os embriões podem ser eficientemente electroporated logo dia embrionário (E) 11,5, enquanto a segmentação de embriões mais jovens exigiria uma ultra-sonografia protocolo de microinjeção, como descrito anteriormente 6. Por outro lado, E15.5 é a última fase, pode facilmente electroporate, devido ao aparecimento de parietal e diferenciação osso frontal, o que dificulta microinjeção no cérebro. Em contraste, a retina é acessível através do fim da embriogênese. Embriões podem ser coletados em nenhum momento durante o período embrionário ou pós-natal precoce. Injeção de uma construção repórter facilita a identificação de células transfectadas. Até à data, em eletroporação utero tem sido mais utilizado para a análise do desenvolvimento neocortical 1,2,3,4. Estudos mais recentes têm como alvo a retina embrionária 7,8,9 e tálamo 10,11,12. Aqui, apresentamos uma modificação no útero protocolo de eletroporação que pode ser facilmente adaptado a diferentes domínios alvo do SNC embrionárias. Nós fornecemos evidências de que usando esta técnica, podemos atingir o embrionárias telencéfalo diencéfalo e retina. Resultados representativos são apresentados, primeiro mostrando o uso desta técnica para introduzir DNA construções de expressão para os ventrículos laterais, o que nos permite monitorar a maturação de células progenitoras, diferenciação e migração no telencéfalo de embriões. Também mostramos que esta técnica pode ser usada para DNA-alvo para os territórios diencefálica em torno do 3 º ventrículo, permitindo que as rotas migratórias de diferenciar neurônios em núcleos diencefálica a ser monitorado. Finalmente, nós mostramos que o uso de micromanipuladores nos permite com precisão introduzir DNA construções em áreas-alvo de pequeno porte, incluindo o espaço sub-retiniano, permitindo-nos analisar os efeitos de manipular a expressão genética no desenvolvimento da retina.

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Neurociência

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC<i&gt; via</i&gt; Artéria carótida interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...