Name: efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Eva Hadzimova, Mattar Pierre y Kovach Christopher por su trabajo inicial en el establecimiento en la tecnología de electroporación in utero en el laboratorio de CS. Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) subvención (44.094 MOP) y CIHR / Fundación Fighting Blindness (FFB) Nuevas equipo de Grant (00933-000) a CS y el Hospital de Niños de Alberta una beca de la Fundación de Investigación de DMK. RD fue apoyado por una beca HOPE CIHR Canadá, RC se apoya en una Beca FFB y LML fue apoyado por una beca de formación CIHR en Genética y Desarrollo Infantil.

1. Set-up <ol><li> Set-up área quirúrgica, como se muestra en la figura. 1A, A &#39;. Los componentes clave de la puesta en marcha incluye un Eppendorf FemtoJet microinyector, micromanipulador Narishige con porta-agujas, steromicroscope Leica, sistema de iluminación por fibra óptica, sistema de ECM 830 electroporación Plaza de la onda con electrodos, una almohadilla eléctrica y un vaporizador de isoflurano anestesia. </li><li> Limpie todas las herramientas con un limpiador ultrasónico con Bransonic Metriclean2 ...

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	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236.">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li><li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity.">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries:+implications+for+neuronal+repair.">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li></ol>

En el útero de la electroporación se puede utilizar para analizar una amplia variedad de procesos de desarrollo. Por ejemplo, la transfección de genes reporteros, como las buenas prácticas agrarias, mCherry o fosfatasa alcalina puede ser utilizado para llevar a cabo el linaje de búsqueda y experimentos de migración neuronal. Por otra parte, la recombinasa Cre puede ser transitoriamente expresó que la eliminación selectiva de un alelo floxed en un espacio y / o de manera temporal controlada. Además, shR...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Categoría </th></tr><tr><td> Tijeras finas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Iris tijeras curvas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicado Porta-agujas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Anillo de pinza, de 9 mm </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Ojo vestirse Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Tejido pinza Adson- </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Reflejo de aplicador de clip </td><td> Mundial de instrumentos de precisión </td><td> 500343 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Cuchara perforada, 15 mm de diámetro </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Seda Negro trenzado de sutura </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Reflejo de la piel de cierre inoxidable clips de acero herida </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 500346 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> ECM 830 electroporación sistema de onda cuadrada </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinzas w / Brecha variable 2 Ronda de 5 mm de electrodo de platino Plate </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinzas w / Brecha variable 2 Ronda 7mm electrodo de platino Plate </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet microinyector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Control de pie de Eppendorf FemtoJet microinyector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc) </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Modelo Bransonic limpiador ultrasónico 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952-118 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipeta Extractor </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipetas - borosilicato con filamento de OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, 10 cm de longitud </td><td> Sutter Instrumento </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> 3-ejes manipulador grueso </td><td> Carl Zeiss Canadá Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Dispositivo de sujeción magnética para micromanipulador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> M1 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Placa base para micromanipulador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 5052 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta titular </td><td> Mundial de la PrDECISIÓN Instrumentos </td><td> MPH3 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta Mango </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 5444 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Vaporizador de isoflurano anestesia </td><td> Porter Instrumentos Empresa </td><td> MODELO 100-F </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Metriclean2 solución de baja espuma para ultrasonidos instrumentos quirúrgicos </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml en 0,2 g azul de metileno spray antibiótico después de la sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Germex para la esterilización de instrumentos quirúrgicos </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> BNP pomada oftálmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuido por Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> disponibles en el mercado </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v piel más limpia </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> La buprenorfina (Temgesic) analgésico </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; sulfametazina antibiótico oral </td><td> Profesionales de Laboratorios Veterinarios </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Solución de Ringer lactato </td><td> Baxter Corporación </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Saline - 0,9% de cloruro sódico </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Anestésicos por inhalación - El isoflurano USP </td><td> Pharmaceutical Partners Inc. de Canadá </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

La capacidad de manipular la expresión génica es la piedra angular de la moderna embriología experimental, lo que lleva al esclarecimiento de múltiples vías de desarrollo. Varias tecnologías transgénicas potente y bien establecidas están disponibles para manipular los niveles de expresión de genes en el ratón, lo que permite la generación de los modelos de la pérdida y ganancia de función. Sin embargo, la generación de ratones transgénicos resulta costoso y el tiempo. Métodos alternativos de la manipulación genética han sido ampliamente tratado por lo tanto. En el útero de la electroporación es un método de entrega de genes en ratones vivos 1,2 embriones que se han adaptado con éxito 3,4. Se basa principalmente en el éxito de las tecnologías de la electroporación in ovo que se utilizan comúnmente en chica 5. En pocas palabras, el ADN es inyectado en los ventrículos abierta del cerebro en desarrollo y la aplicación de una corriente eléctrica provoca la formación de poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la absorción de ADN en la célula. En nuestras manos, los embriones pueden ser eficientemente electroporated a partir del día embrionario (E) 11,5, mientras que la focalización de los embriones más jóvenes que requieren una guiada por ultrasonido protocolo microinyección, como se describió anteriormente 6. Por el contrario, E15.5 es la última etapa que puede electroporar, debido a la aparición de los parietales y la diferenciación de hueso frontal, lo que dificulta la microinyección en el cerebro. Por el contrario, la retina se puede acceder a través del final de la embriogénesis. Los embriones se pueden recoger en cualquier punto durante todo el período postnatal embrionario o temprano. La inyección de un reportero construir facilita la identificación de las células transfectadas. Hasta la fecha, en la electroporación in utero ha sido más utilizado para el análisis del desarrollo neocortical 1,2,3,4. Los estudios más recientes se han centrado en el embrión de la retina y el tálamo 7,8,9 10,11,12. A continuación, presentamos una modificación en el protocolo de electroporación in utero que puede ser fácilmente adaptada a los diferentes dominios de destino del sistema nervioso central embrionario. Aportar pruebas de que mediante el uso de esta técnica, podemos apuntar el telencéfalo diencéfalo embrionario, y la retina. Los resultados representativos se presentan, en primer lugar que muestra el uso de esta técnica para introducir las construcciones de expresión de ADN en los ventrículos laterales, lo que nos permite controlar la maduración progenitor, diferenciación y migración en el telencéfalo embrionario. También muestran que esta técnica puede ser utilizada para combatir el ADN de los territorios que rodean el ventrículo diencefálico 3 º, lo que permite las rutas migratorias de diferenciar las neuronas en los núcleos diencefálicos a ser monitoreados. Por último, se muestra que el uso de micromanipuladores nos permite introducir con precisión construcciones de ADN en las áreas objetivo pequeño, como el espacio subretiniano, lo que nos permite analizar los efectos de la manipulación de la expresión de genes en el desarrollo de la retina.

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Guiada por ultrasonido microinyección en el cerebro anterior Ratón In Utero En E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Investigación

Neurociencias

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gen de entrega de cerebro de rata postnatal por la inyección no ventricular plásmido y electroporación

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Técnica ratón Microcirugía de infusión para Targeted Sustancia de entrega en el SNC<i&gt; vía</i&gt; La arteria carótida interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...