Name: efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation at JoVE.com

Författarna vill tacka Eva Hadzimova, Pierre Mattar och Christopher Kovach för sitt inledande arbete att etablera i livmodern elektroporering teknik i CS labbet. Detta arbete har finansierats av en kanadensisk Institute of Health Research (CIHR) bevilja (MOP 44.094) och CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Team Grant (00.933-000) till CS och ett Alberta Barnsjukhuset Research Foundation Bidrag till DMK. RD stöddes av en CIHR Kanada Hope Scholarship är RC stöds av en FFB utbildningsbidrag och LML stöddes av en CIHR Training Grant i genetik och barns utveckling.

1. Set-up <ol><li> Set-up operationsområdet som visas i bild. 1A, A &quot;. Viktiga komponenter i set-up ingår ett Eppendorf Femtojet microinjector, Narishige mikromanipulator med nål hållare, Leica steromicroscope, fiberoptisk belysning, ECM 830 Square Wave elektroporation System med elektroder, värmedyna och en förångare för isofluran bedövningsmedel. </li><li> Rengör alla verktyg med ett Bransonic ultraljudsrengörare med Metriclean2 Lågskummande lösning för sonicating kirurgiska verktyg. Sterilisera v...

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236.">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li><li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity.">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries:+implications+for+neuronal+repair.">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li></ol>

I livmodern elektroporation kan användas för att analysera en mängd olika utvecklingsprocesser. Till exempel kan transfektion av reporter gener som GFP, mCherry eller alkaliska fosfataser tillgripas för att genomföra härstamning spårning och neuronala experiment migration. Alternativt kan Cre recombinase vara tillfälligt uttryck för att selektivt eliminera en floxed allel hos ett rumsligt-och / eller tidsmässigt-kontrollerat sätt. Dessutom kan shRNA eller dominerande negativa konstruktioner vara elec...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn på reagens </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kategori </th></tr><tr><td> Fin sax </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 14.078-10 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Iris sax, böjda </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 14.061-10 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delikat nål </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 12.002-12 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Ring pincett, 9mm </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 11.103-09 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Eye dressing Forcep </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 11.051-10 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Forcep </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 11.271-30 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Forcep </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 11.251-30 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Tissue forcep-Adson </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 11.027-12 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Reflex Clip Applier </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 500.343 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Perforerad Spoon, 15 mm diameter </td><td> Fine Science Tools Inc. </td><td> 10.370-18 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427.637 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Silk Svart Flätad Suture </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> Reflex hudförslutnings rostfritt stål Sår klipp </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 500.346 </td><td> Kirurgiska instrument </td></tr><tr><td> ECM 830 Square Wave elektroporation System </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Pincett w / Variabel Gap 2 Runda 5mm Platinum tavla elektrod </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Pincett w / Variabel Gap 2 Runda 7mm Platinum tavla elektrod </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Eppendorf Femtojet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Foot Control för Eppendorf Femtojet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Bransonic ultraljudsrengörare modell 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952-118 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Sutter P97 mikropipett Puller </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Mikropipetter - Borosilicate med glödlampa OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, 10 cm längd </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> 3-axlig Grov Manipulator </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Magnetisk hållare för mikromanipulator </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> M1 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Stål Basplatta för mikromanipulator </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 5052 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Mikropipett Hållare </td><td> World PrBESLUT Instrument </td><td> MPH3 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Mikropipett Handtag </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 5444 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Vaporizer för isofluran anestesi </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODELL 100-F </td><td> Instrument </td></tr><tr><td> Metriclean2 Lågskummande lösning för sonicating kirurgiska instrument </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Gentamicin 40mg/ml i 0,2 g metylenblått antibiotika spruta efter suturering </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Germex för sterilisering av kirurgiska instrument </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> BNP oftalmologiska salva </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribueras av Church &amp; Dwight Co, Inc. </td><td> kommersiellt tillgängliga </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v huden renare </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Buprenorfin (Temgesic) smärtstillande </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; sulphamethazine orala antibiotika </td><td> Professional Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Ringer-laktat lösning </td><td> Baxter Corporation </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Saline - 0,9% natriumklorid </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Inhalationsanestesi - Isofluran USP </td><td> Pharmaceutical Partners Canada Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr><tr><td> Snabb grön-orange </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Kirurgiska Reagenser </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

Förmågan att manipulera genuttryck är hörnstenen i dagens moderna experimentella embryologi, vilket leder till att klarlägga flera utvecklingsbanor. Flera kraftfulla och väl etablerade transgena tekniker finns tillgängliga för att manipulera nivåer genuttryck i musen, vilket möjliggör generering av både förlust och vinst-of-funktionen modeller. Men den generation av musen transgena både kostsamt och tidskrävande. Alternativa metoder för genmanipulation har därför fått stor eftersträvas. I livmodern elektroporation är en metod för gen leverans till levande musembryon 1,2 att vi framgångsrikt har anpassat 3,4. Det är till stor del bygger på framgången för i ovo elektroporering teknik som ofta används i chick 5. Kortfattat är DNA injiceras i öppna ventriklar av den växande hjärnan och tillämpningen av en elektrisk ström ger upphov till bildning av övergående porer i cellens membran, som möjliggör upptag av DNA in i cellen. I våra händer, kan embryon vara effektivt electroporated så tidigt som embryonala dag (E) 11,5, medan inriktningen av yngre embryon skulle kräva ett ultraljud-styrda mikroinjektion protokoll, som tidigare beskrivits 6. Omvänt är E15.5 den senaste fasen kan vi enkelt electroporate, på grund av uppkomsten av parietala och frontala ben differentiering, vilket försvårar mikroinjektion in i hjärnan. Däremot är näthinnan tillgänglig till slutet av fosterutveckling. Embryon kan samlas vid någon tidpunkt under hela embryonal-eller tidiga postnatala perioden. Injektion av en reporter konstruktion underlättar identifieringen av transfekterade cellerna. Hittills har i livmodern elektroporering varit mest använda för analys av hjärnbarkens utveckling 1,2,3,4. Nyare studier har riktat in den embryonala näthinnan 7,8,9 och Thalamus 10,11,12. Här presenterar vi en modifierad i livmodern elektroporering protokoll som lätt kan anpassas för att rikta olika områden av den embryonala CNS. Vi ger belägg för att med hjälp av denna teknik kan vi rikta den embryonala telencephalon, diencephalon och näthinnan. Representativa resultat presenteras, först som visar användningen av denna teknik att införa konstruktioner DNA uttryck i de laterala ventriklarna, tillåter oss att övervaka stamfader mognad, differentiering och migration i den embryonala telencephalon. Vi visar också att denna teknik kan användas för mål-DNA till diencephalic områdena kring den 3: e ventrikeln, vilket gör att flyttvägar att differentiera nervceller i diencephalic kärnor som skall övervakas. Slutligen visar vi att användningen av micromanipulators ger oss möjlighet att exakt införa DNA-konstruktioner i små målområden, inklusive subretinal utrymme, tillåter oss att analysera effekterna av att manipulera genuttryck på näthinnan utveckling.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation at JoVE.com

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

I livmodern elektroporation möjliggör snabb genen leverans i ett rumsligt och tidsmässigt-kontrollerat sätt i utvecklingsländerna centrala nervsystemet (CNS). Här beskriver vi en mycket anpassningsbar i livmodern elektroporering protokoll som kan användas för att leverera uttryck konstruktioner i flera embryonala CNS-domäner, inklusive telencephalon, diencephalon och näthinnan.

Effektiv Gene Delivery i flera CNS territorierna Använda I Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Ultraljud-Guidad mikroinjektion i musen framhjärnan I Utero På E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

I livmodern elektroporation följt av primär Neuronala Kultur för att studera geners funktion i Delmängd av kortikal Neuroner

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Leverans till Postnatal råtthjärna av icke-ventrikulär Plasmid Injection och elektroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mus I livmodern Elektroporation: Kontrollerad Spatiotemporal Gene Transfektion

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Lokalt Transgena råttor genom<em&gt; I livmodern</em&gt; Elektroporering och<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genmanipulation av Mouse Utveckla Hypothalamus genom<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporering

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mus Mikro Infusion Teknik för riktad substanstillförsel i CNS<i&gt; via</i&gt; Den inre Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse-konfokalbildning av migrerande neuroner i organotypisk skivkultur av embryonalt mushinne<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...