Name: preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis at JoVE.com

وأود أن أشكر الدكتور جنيفر كيرتس للصور في الشكل. (1) وجيريمي والدكتور فلورنسا فاغان مارلو لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم عملنا المعاهد الوطنية للصحة منح 1R01GM088202.

<ol>
	<li>Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Mst+ortholog,+hippo,+restricts+growth+and+cell+proliferation+and+promotes+apoptosis.">The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis.</a> Cell. 114, 457-457 (2003).</li><li>Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Trithorax+group+protein+Lid+is+a+trimethyl+histone+H3K4+demethylase+required+for+dMyc-induced+cell+growth.">The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth.</a> Genes Dev. 21, 537-537 (2007).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Drosophila+eye+differentiation.">Principles of Drosophila eye differentiation.</a> Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye.">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+Ommatidium.">Cell fate in the Drosophila Ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).</li><li>Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle+and+Strabismus+form+a+functional+complex+to+generate+a+correct+axis+during+planar+cell+polarity+signaling.">Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling.</a> Embo J. 22, 4409-4409 (2003).</li><li>Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=frizzled+regulates+mirror-symmetric+pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye.</a> Development. 121, 3045-3045 (1995).</li><li>Reinke, R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interaction+in+the+Drosophila+Retina:+The+bride+of+sevenless+Gene+is+required+in+photoreceptor+cell+R8+for+R7+cell+development.">Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development.</a> Cell. 55, 321-321 (1988).</li><li>Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=strabismus,+a+novel+gene+that+regulates+tissue+polarity+and+cell+fate+decisions+in+Drosophila.">strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila.</a> Development. 125, 1149-1149 (1998).</li><li>Winter, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rho-associated+kinase+(Drok)+links+Frizzled-mediated+planar+cell+polarity+signaling+to+the+actin+cytoskeleton.">Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton.</a> Cell. 105, 81-81 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1223 (1993).</li><li>Stocker, H., Gallant, P., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-27 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ذبابة الفاكهة واستخدام نموذج حي ، وشاشات وراثية أدت إلى تحديد العديد من الأعضاء المؤسسين للعائلات الجينات الأساسية لمعظم المسارات المحفوظة للغاية مما يشير الى ارتفاع حقيقيات النواة بما فيها البشر. منذ ذلك الحين ، تحت ظروف المختبر ، والعين هي وظيفية يمكن الاستغناء عنها من أجل البقاء ، والعين هي الأنسجة وخاصة مناسبة تماما لاكتشاف وظائف الجينات رواية وتقييم الشبكات الجينية. تحليل التركيبية للعين الذبابة باستخدام الطريقة الموصوفة وبالتالي أدى إلى اكتشافات الأساسية ذات الصلة من أجل التنمية والمرض. في البداية ، تم إجراء تحليل وحيد الخلية نسيلي باستخدام الأشعة السينية التي يسببها استنساخ جنبا إلى جنب مع علامات الخلية يعرف الحكم الذاتي مرتبطة ارتباطا وثيقا المتنحية. في الآونة الأخيرة ، وقد سهلت توافر نظام FLP / FRT لتوليد الحيوانات المستنسخة كثيرا من التحليل المظهرية للطفرات المميتة في أقسام العيون 6،9. ولا يقتصر تحليل المقاطع إلى مقاطع عرضية العين الموصوفة هنا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن محاذاة الرؤوس في أي اتجاه في قوالب ويمكن الحصول على المقاطع العرضية لدراسة الطبقات الأعمق في رأسه مثل الصفيحة والنخاع. بروتوكول الموصوفة هنا هو بالتالي وسيلة لتحليل تنوعا من البالغين العين ورأس ذبابة الفاكهة الهياكل.

معدات عامة : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتربية ذبابة عامة انظر 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجهر تشريح القياسية (مثل نيكون ستيريو تكبير المجهر SMZ - 645) ، ويفضل مع عصابة مصدر للضوء لمنع يلقي ظلالا من يديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CO 2 وسادة يطير ، مع تغطية ورقة Whatman 3mm ل توفير حماية ضد الأوساخ أثناء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح المغلفة الجيلاتين : الجيلاتين ويذوب 10G 1G CrKSO 4 × 12 H 2 O في المياه 1L على طبق من ذهب للتدفئة (تقريبا جلب ليغلي ، ويأخذ ما يقرب من 2 ساعة). تراجع الشرائح غسلها جيدا (الصابون) وتشطف (DH 2 O) في حملة الى حل الجيلاتين والهواء الجاف المغطاة برقائق بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرن التسخين (70 درجة مئوية ، ومناسبة تماما فراغ الأفران القديمة التي كانت تستخدم لتجفيف مرشح النيتروسليلوز لهذا الغرض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشراح قادرة على sectioning سامسونج (0.5-1 أبواب سميكة ميكرومتر) ، مثل تلك المستخدمة من قبل مرافق المجهر الإلكتروني. نستخدم MT5000 Sorvall مشراح مستدق مع الماس Histo سكين الجودة. السكاكين والزجاج العمل أيضا. </li></ul> تثبيت الحلول : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الأسهم من 0.2 م العازلة الفوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غلوتارالدهيد الصوديوم 2 ٪ في 0.1M العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.2 (يمكن تخزينها في 4 أسابيع 4 درجات مئوية ل). جعل الأقل بما يكفي ليكون في التركيب الوراثي 200μl تريد تضمين. تبقي على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوزميوم الحل : 2 ٪ 4 في أوسو الصوديوم 0.1M العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.2. تقديم ما يكفي فقط أن يكون في التركيب الوراثي 200μl تريد تضمين ، لأن لا يمكن أن يكون الحل المخزنة. تبقي على الجليد. </li></ul> غلوتارالدهيد وأوسو 4 سامة للغاية وينبغي التعامل معها بعناية فائقة في غطاء جيد التهوية. نصائح استخدام التصفية عند التعامل مع أوسو 4 لمنع اسوداد من ماصة الخاص. الجفاف : جعل 30 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ ، (80 ٪) ، 90 ٪ ، والحلول الإيثانول بنسبة 100 ٪. بارد ويفضل 30 ٪ و 50 ٪ و 70 ٪ من الإيثانول على الجليد قبل الاستخدام. تلطيخ الحل : 1 ٪ طولويدين الأزرق في البوراكس 1 ٪. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th></th><th> ناعم </th><th> الثابت </th></tr><tr><td> والراتنج </td><td> 54G </td><td> 50G </td></tr><tr><td> تصليب B </td><td> 44.5g </td><td> 50G </td></tr><tr><td> مسرع C </td><td> 2.5G </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> الملدنات D </td><td> 10G </td><td> 0.75g </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الراتنج إعداد لإعداد الراتنج ، وبعناية ، ولكن خلط جميع المكونات جيدا في كوب من البلاستيك باستخدام مغناطيسي مع بقضيب كبير. تجنب الفقاعات. بعد قسامة ، والخلط في قوارير أو حاويات قياسية التلألؤ وتجميد مماثل على -20 درجة مئوية. استخدام الراتنج ميسرة لجميع الطلبات ما لم يكن لديك EM مرفق يسألك عن صعوبة الصياغة. استخدام قفازات للتعامل مع الراتنج (مادة مسرطنة في شكله unpolymerized). لتتبلمر راتنج على المعدات والنفايات ، ويخبز في 70 درجة مئوية خلال الليل. ثم قد يكون التخلص منها بأمان من النفايات والمعدات تنظيفها وإعادة استخدامها. ويمكن تنظيف تسرب راتنج unpolymerized مع الأيزوبروبانول. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> المزود </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> يطير سادة </td><td> على سبيل المثال جينيسي </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> غلوتارالدهيد </td><td> سيغما </td><td> G7526 - 10 X 10 ML </td></tr><tr><td> 4 OSO </td><td> Polysciences ، وشركة </td><td> 0972A - 20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> الصياد </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> مشرط المقابض ، ل# 3 </td><td> الصياد </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> شفرات المشرط # 11 </td><td> الصياد </td><td> 08-916 - 5B </td></tr><tr><td> نقل ماصات </td><td> الصياد </td><td> 13-711 - 7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM الراتنج </td><td> سيغما (Fluka) </td><td> 44610 - 1EA </td></tr><tr><td> إبرة تشريح الصلب </td><td> الصياد </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM العفن تضمين المسطحة </td><td> الإلكترون المجهري الكيمياء. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> شفرات الحلاقة المطلية تفلون </td><td> الإلكترون المجهري الكيمياء. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q - غيض (مسحات معقمة) </td><td> الصياد </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> الشرائح الزجاجية </td><td> الصياد </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> تغطية زلات رقم (1) ، 22X60 مم </td><td> الصياد </td><td> 12 - 531K </td></tr><tr><td> الجيلاتين </td><td> الصياد </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> الكروم (III) SO 4 K dodecahydrate </td><td> سيغما </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> الماس Histo سكين ، 6mm </td><td> Diatome الولايات المتحدة </td><td> صاحب 60 </td></tr><tr><td> طولويدين يا الأزرق </td><td> الصياد </td><td> BP107 - 10 </td></tr><tr><td> البوراكس (بورات ثنائي نا) </td><td> الصياد </td><td> AC20629 - 1000 </td></tr><tr><td> DPX تصاعد المتوسطة </td><td> سيغما </td><td> 44581 - 100ML </td></tr></tbody></table> الجدول 2. المواد

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة تستخدم نظام نموذجي لدراسة التنمية ، ويرجع ذلك أساسا إلى السهولة التي كان لين العريكة وراثيا. على مر السنين ، وقد وضعت مجموعة كبيرة من سلالات متحولة والحيل التقنية للسماح أسئلة معقدة والإجابة عليها في كمية معقولة من الزمن. لقد تم الحصول على الرؤية الاساسية في تفاعل مكونات جميع الممرات الرئيسية المعروفة في إشارة إلى الأمام وعكس الدراسات الجينية ذبابة الفاكهة. وقد ثبت للعين أن يطير جيدا بشكل استثنائي مناسبة لتحليل طفرية ، منذ ذلك الحين ، تحت ظروف المختبر ، والذباب يمكن أن يعيش من دون عيون وظيفية. وعلاوة على ذلك ، يتألف سطح العين الحشرات من بعض العيون 800 وحدة الفرد (أو جوانب ommatidia) الذي شكل منتظم ، وسطح أملس عندما نظرت إلى تشريح تحت المجهر. وهكذا ، فإنه من السهل أن نرى ما إذا كان قد تحور تؤثر على التنمية العين أو النمو من خلال النظر خارجيا لفقدان سطح أملس (&#39;العين الخام&quot; النمط الظاهري ؛ الشكل 1) أو الحجم الكلي العين ، على التوالي (للاطلاع على أمثلة من الشاشات على أساس مورفولوجيا العين الخارجية انظر على سبيل المثال 1). تحليلات مفصلة لاحقة من الظواهر تتطلب تثبيت العين ، تضمين البلاستيك ورقيقة sectioning عيون الكبار. عين ذبابة الفاكهة يطور من القرص العين يسمى تخيلي ، كيس من الخلايا الظهارية التي تتكاثر والتفريق خلال مراحل اليرقات والعذراء (انظر 2 للمراجعة مثلا). كل ommatidium يتكون من 20 زنزانة ، بينهم ثمانية من المستقبلات الضوئية (PR أو R الخلايا ؛ الشكل رقم 2) ، وأربع خلايا مخروطية عدسة إفراز ، الخلايا الصبغية (&#39;السداسي&quot; حول الخلية R - الكتلة) وشعيرات ملف. ومبصرات كل ommatidium ، ومعظم التعرف عليها بسهولة من قبل هذه العضيات الحساسة للضوء ، rhabdomeres ، هي التي نظمت في شبه المنحرف تتكون من &quot;الخارجي&quot; ستة (R1 - 6) واثنين من &quot;الداخلية&quot; المستقبلات الضوئية (R7 / 8 ؛ R8 [التين 2] هو تحت R7 ، وبالتالي ينظر فقط في الفروع من المناطق العميقة من العين). يتم محاذاة بدقة شبه منحرف من كل جانب مع تلك جيرانها والمحاور الشاملة وظهري بطني الأمامي الخلفي من العين (الشكل 3A). على وجه الخصوص ، من ommatidia (الأسهم السوداء والحمراء ، على التوالي) وظهري بطني نصفين من العين هي صور طبق الأصل من بعضها البعض ، وتتوافق مع شكلين مراوان مستو وضعت خلال إشارات الخلية القطبية (انظر على سبيل المثال للمراجعة 3). وصف طريقة لتوليد أقسام العين شبه رقيقة (مثل تلك التي قدمت في الشكل 3) هنا هو تعديل طفيف من وصفها توملينسون في الأصل من قبل وجاهز 4. فهو يسمح للتحليل الصرفي لجميع الخلايا باستثناء الخلايا المخروطية شفافة. بالإضافة ، يمكن استخدام صبغة R - الخلايا (السهام الزرقاء في الشكل 2 و 3) كعلامة خلية مستقلة عن التركيب الوراثي للخلية - R ، ومتطلبات الوراثية وبالتالي من الجينات في مجموعة فرعية من الخلايا يمكن R بسهولة يمكن تحديد 5،6.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis at JoVE.com

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

نهج موحد لإعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</emويرد&gt; عيون لشبه رقيقة sectioning والتحليل المجهري الضوء هنا. ويمكن استخدام بروتوكول للتحليل الصرفي من العيوب الجسيمة العين ، أو يمكن استخدامها مع التعديلات وأشار إلى تحديد الاحتياجات من الجينات الوراثية في أنواع معينة من الخلايا في العين (تحليل نسيلي مبصرات مثلا) أو لأغراض التحليل المجهري الإلكترون.

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Sectioning رقيقة من الاستعدادات لشريحة المناعية

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

تسجيلات كاملة من خلية دماغ ذبابة الفاكهة الكبار

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

ليزر التقاط ميكروديسيكشن من ميشوورك ترابيكولار نقية جداً من عيون الماوس لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...