Name: preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis at JoVE.com

אני רוצה להודות ד&quot;ר ג&#39;ניפר קרטיס עבור התמונות איור. 1 וג&#39;רמי פייגן וד&quot;ר פלורנס מרלו עבור אנושות לקרוא את כתב היד. העבודה שלנו היא נתמכת על ידי NIH מענק 1R01GM088202.

1. טוס לנתיחה ראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש לך את כל החומרים בהישג יד (כולל שקופיות מצופה ג&#39;לטין). הכן glutaraldehyde ו fixatives אוסמיום (ראה להלן). לפי גנוטיפ להטביע, glutaraldehyde 200μl aliquot פתרון לתקן את הצינורות בתוך 1.5 מ&quot;ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים על כרית CO 2 (אנחנו בדרך כלל לנתח שבעה ראשים עפים להטביע שישה אחוזים גנוטיפ במקרה ראש אחד נהרס במהלך ההליך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מעט בעיתונות החזה של הצד לעוף, הגב, עם פינצטה ולהשתמש אזמל חד לחתוך את הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את הראש לטוס ידי נגיעה בצוואר עם פינצטה ובזהירות לחתוך חלק קטן של עין אחת. זו משפרת חדירה של מקבע (אם אתם מתכוונים להשתמש במקטעים העין לניתוח המשובטים, לחתוך את העין עם שיבוטים או לא קטן). הימנע מנגיעה ומזיק העין שלמים אשר מאוחר יותר להיות מחולק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע ראש עם פינצטה או אזמל על פני השטח של החתך מעל העין ולהעביר את הראש לתוך מקבע glutaraldehyde / פוספט על הקרח (ראשי קרובות לצוף על גבי מקבע) ראשי גזור לא צריך להיות כל הזמן לתקן glutaraldehyde למשך זמן ארוך יותר יותר מאשר 15 דקות לפני תוספת של אוסמיום. חזור על שלבים 1.2-1.5 עם זבובים אחרים של גנוטיפ זהה. </li></ol> 2. קיבוע והטבעה (להשתמש בכפפות במשך כל השלבים!) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין flyheads בצנטריפוגה Eppendorf דקה 1 בסל&quot;ד 10,000. המשך גם אם הראש לא לשקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μl של פתרון 4 OSO ולתקן במשך לפחות 30 דקות עד 1 שעה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להסיר את הפתרון glutaraldehyde / אוסמיום (לוודא שימוש נכון לרשות נהלים בזבוז!) ולהחליפו פתרון אוסמיום 200μl. לדגור על הקרח במשך 1-6 שעות. תמיד להבטיח את ראשיהם מכוסים לגמרי בנוזל ולא להסיר את כל הפתרון כמו ראשי או העיניים עלול להתמוטט! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להשליך מקבע, להוסיף אתנול 0.5-1ml 30% ו דגירה במשך לפחות 5 דקות על קרח (כדי לוודא שימוש נכון סילוק פסולת הליכים מאז אתנול מכיל כעת אוסמיום!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב עם מעל 50%, 70%, (80%), 90% ו 100% אתנול פעמיים. כלול את הצעד אתנול 80% אם באמצעות העיניים לניתוח מיקרוסקופית אלקטרונים. לאחר השלב לשטוף 70%, הדגימות ניתן להסיר את הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את אתנול עם נפח שווה של פרופילן אוקסיד (נדיפים, להמשיך לעבוד למכסה המנוע). דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פרופילן אוקסיד. עבודה בקבוצות אם עיבוד גנוטיפים רבים במקביל, כדי למנוע התמוטטות של העיניים עקב התאדות של פרופילן אוקסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של פרופילן אוקסיד באמצעות פיפטה העברת פלסטיק, להוסיף על 500μl של 01:01 שרף: פתרון פרופילן אוקסיד. לאזן בין לילה בטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. הטבעת ואת הסדר בתוך תבניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל תבניות מסומנים כדי לעקוב אחר גנוטיפים שונים שלך, ולאחר מכן למלא את תבניות עם שרף 100%. אל תמלא יותר מדי (לא &#39;ההרים הגבוהים&#39; על פני השטח של תבניות כאשר מסתכל ישר על פני התבנית). השתמש שרף קשה לניתוח EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה להעביר, להסיר את שרף 50% מן הראשים, להחליף עם שרף 100%, דגירה של 3-4 שעות בטמפרטורת החדר. כראשי הם הסתננו עם שרף, הם ישקעו לתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קיסם כי נפגעה על משטח קשה פעם אחת כדי ליצור וו קטן, להעביר ראש אחד בזמן לתוך תבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רדיד אלומיניום במקום על שטח העבודה של היקף הניתוחים שלך ולהגן עליו מפני דליפות שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת איזמל המנתחים ונראה כאילו מערבולת שלך, היקף הראש מעט שרף בזהירות להזיז אותו לתחתית התבנית קרוב לסוף הצביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות ליישר את פני השטח של העין (!) הצוואר שלם (או מטוס העתיד שלך חתך אם אתה רוצה להיות חתכים) למטה עם הקיר הקדמי של עובש, והקפד לשמור את פני השטח של העין משיק בערך חצי ראש קוטר מהקיר עובש. במקרים נדירים, מתמוטט העין אשר ניתן לראות חלל ריק בין פני השטח את העין ואת הראש לציפורן. אם יש לך עין התמוטט, להחליף אותו עם העין חילוף 7 ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם ראשי כל. פעם עשיתי עם מערכים כל, לבדוק מחדש את כל העיניים כדי לוודא שהם לא זז כאשר אתה מוסר את המחט של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש לך בעיה עם העיניים לנוע כאשר אתה מסיר את איזמל המנתחים, מקם את העין לפי הצורך, לחזור בו במהירות את המחט מעט מן הראש ואז לאט לאט להוציא את המחט לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים את תבניות לילה בשעה 70 ° C. </li></ol> 4. זמירה ו חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוסמת מוקשה מתבניות על ידי כיפוף תבניות, kמסלול eeping מהם לחסום מתאים אשר גנוטיפ (למשל חנות צלוחיות קטנות הנצנץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זמירה, השתמש צ&#39;אק מתאים microtome שלך ​​כי הוא רכוב על הפנים גוש של פלסטיק או אלומיניום. הר אבן לקצץ, עין למעלה, צ&#39;אק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פי היקף לנתיחה באמצעות סכין גילוח מצופה טפלון בירך, בזהירות לחתוך רק את השכבה העליונה של הבלוק שלך. זה ישאיר משטח אשר ברור כי אתה צריך לראות את העין ולכן יכול לחזות את מטוס העתיד של חתך. הימנע חיתוך האצבעות! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עודפי פלסטיק משני צידי הראש בחזית (כלומר, מה היה אמור להיות החלק העליון של התבנית כאשר ליישר את העיניים) עד שרוב הפלסטיק סביב ראשו נכרת. עדיף להתקרב לאט לאט הראש על ידי חיתוך שכבות דקות רבות של פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח נקי, להסיר בזהירות שכבות דקיקות מהחלק העליון של העין במישור המדויק שאתה רוצה בהמשך (בדרך כלל בנקודת השקה העין, בזווית קלה אל פני השטח את התבנית המקורית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עד שאתה פשוט להתחיל לחתוך את המשטח החיצוני של העין. הקפד להשתמש באזורים נקי של הלהב כדי לקבל משטח מבריק, שקוף, מה שהופך את היישור קל יותר microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על סכיני גילוח, סכיני להשתמש יותר עבור גס זמירה סביב הצדדים של הבלוק ולהשתמש להב טרי עבור זמירה קנס (חתך ראשון 4.6). בסופו של דבר יהיה לך פירמידה צדדית שלושה עם צמרת מוטה מעט חתוכים, שמתאים מטוס סעיף העתיד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר לחסום microtome. חתך בפועל ישתנו בהתאם לסוג של microtome ולא יהיה מתואר בפירוט כאן. אנו משתמשים Sorvall MT5000 עם סכין יהלום באיכות histo לקצץ 0.5 ל 1μm חלקים. ניתוח מיקרוסקופי אור, שינויים קלים עובי סעיף לא משנה. אם שיבוטים חתך מסומן על ידי חלק לבן + transgene, 1μm סעיפים כדי להבטיח שיהיה מספיק גרגרי פיגמנט סמוך rhabdomeres לכל סעיף (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים יצוף על פני המים. הרם first סעיפים 20-30 עם סיום שטוח של קצה-Q עץ מתחת פני המים בתנועה וסיבוב ולהעביר אותם לתוך טיפת מים בשקופית זכוכית מצופה ג&#39;לטין (שמר על צלחת חימום בסביבות 100 ° C ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם עוד 20-30 חלקים. חכו עד שהמים התאדו וחתכים מקל לשקופית. בדרך כלל, קטעים של 3 עיניים מסודרות בשלושה טורים (שלוש עיניים) על ידי שורות twp (למעלה / למטה חלקים) משתלבים היטב בשקופית אחת. </li></ol> 5. מכתים ניתוח מיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם כן שיבוטים חתך, קטעי הכתם. המקום שקופיות עם קטעים על בלוק חימום נקבע על 90 ° C. לוותר Toluidine כחול פתרון מכתים מתוך מזרק 30 מ&quot;ל מצורף מסנן 0.22μm לשקופית ואת הכתם למשך 10 שניות. מיד לשטוף נרחב עם מים מזוקקים. האוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, להפיץ 3 טיפות DPX הרכבה בינונית לשקופית ומכסים coverslip. למעלה עם 3 מטבעות ולתת בינוני להקשיח הרכבה (לילה למשל בטמפרטורת חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה עם מיקרוסקופ אור. השתמש בעדשה או 5x 10x למצוא קטע טוב ולאחר מכן לעבור עדשה שמן 63x טבילה עבור ניתוח מפורט וצילום. אנחנו בדרך כלל להשתמש בהגדרות בניגוד שלב, אבל darkfield אופטיקה לעבוד גם כן. </li></ol> 6. נציג התוצאות: רוב לעיתים קרובות, עיניים המוטבעים פלסטיק ניתוח מפורט של חיצוני פנוטיפים עין גס זוהה כחלק מסך גנטי או בתהליך של בדיקה גנטית אינטראקציות עם גנים ידוע להשפיע גם מבנה העין הקוטביות כללית או. תוצאות אופייניות של חלקים עין מוצגים באיור 3. Wild-type האומטידיה (איור 3A) להראות משלימים photoreceptor מלא מוקף סריג של תאים פיגמנט. לעומת זאת, פזילה (stbm, aka ואן גוך-7) מוטציה, את הקוטביות ommatidial אבד, למרות משלימים photoreceptor מלא קיים, סיבוב כירליות הם אקראיים (איור 3B). יתר על כן, מאז אלל stbm מחולק היה aw - הרקע, גרגרי פיגמנט חסרים באיור. 3B. איור 3C מציג דוגמה של ניתוח משובט. תסיסנית Rho קינאז (drok) נדרש סיבוב ommatidial כמו גם על שלמות מבנית של העין 8. הומוזיגוטים drok 2 שיבוטים ניתן לזהות על ידי העדר פיגמנט בתאי הפיגמנט ואת rhabdomeres (בדרך כלל, שיבוטים הם חסרי עיניים הנגרמת באמצעות-FLP ו-P-אלמנט עם גן הביע בתוקף סמן לבן המשלימה w רקע - מוטציה בטבע סוג ורקמות הטרוזיגוטיים). זה ובכך ניתן לזהות אזורים מוטציה על ידי חוסר פיגמנט. בשל האוטונומיה תאים של פיגמנטציה של ה-R-CElls שהוזכר קודם לכן, גנוטיפ של הפרט R-תאים ניתן לקבוע (ראה ראשי חץ באיור. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. העין תסיסנית היא מערכת מודל מצוינת עבור הביולוגים מאז, בניגוד המשטח החלק של העין wild-type (א), את פני השטח של העין מוטציה היא חיצונית גסה לעתים קרובות (ב), מעיד על פנוטיפים עין הבסיסית . ב כל הדמויות, הקדמי הוא שמאלה הגבי הוא למעלה. תמונות באדיבות ד&quot;ר ג&#39;ניפר קרטיס, NMSU, Las Cruces, NM, ארה&quot;ב. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. תמונות מיקרוסקופיות של אור האומטידיה אחד מחולק באמצעות השיטה המתוארת. רק שבעה R-תאים גלויים בכל פעם לכל אומטידיום, מאז R7 שקרים על גבי R8. (א &#39;, א&#39;) ברמה R7, גוף התא של R7 מזוהה בין R1 ו-R6 (חץ צהוב &quot;). לעומת זאת, ברמה R8 (ב), גוף התא של R8 מזוהה בין R1 ו R2 (חץ צהוב ב &#39;). ראשי חץ כחול מסמנים את גרגרי פיגמנט שיכול לשמש כסמן תאים אוטונומיים פיגמנט. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. סעיפים משיק דרך wild-type (A), stbm (B) drok (C) מוטציה העיניים מבוגר תסיסנית. שרטוטים להלן הסעיפים לציין את הקוטביות של האומטידיה (ראה (א) על החצים). המעגלים מייצגים האומטידיה עם פגמים להשלים את photoreceptor. קווי זהב מייצגים את קו הגב / הגחון של סימטריה (קו המשווה). בניגוד האומטידיה גם אוריינטציה של wild-type (A), הארגון מישוריים הולך לאיבוד מוטציה stbm (B). ראוי לציין, כי סעיף של מוטציה stbm הראו חסר פיגמנט בשל w שלה - רקע מוטנטים. (ג) כי מוטציות drok הם קטלניים, הם צריכים להיות מנותח שיבוטים. לכן, תאים פיגמנט הם wild-type או הטרוזיגוטיים (ראשי חץ כחול מלא), בעוד R-תאים חסר פיגמנט (ראשי חץ כחול פתוח) הם מוטנטים הומוזיגוטים. בנוסף לפגמים סיבוב, מוטנטים drok גם להראות פגמים מבניים לרבות מספרי חסר או עודף של R-תאים. שימו לב לניתוח המשובטים, קטעי אינם מוכתמים כדי למנוע טשטוש גרגרי פיגמנט.

<ol>
	<li>Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Mst+ortholog,+hippo,+restricts+growth+and+cell+proliferation+and+promotes+apoptosis.">The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis.</a> Cell. 114, 457-457 (2003).</li><li>Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Trithorax+group+protein+Lid+is+a+trimethyl+histone+H3K4+demethylase+required+for+dMyc-induced+cell+growth.">The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth.</a> Genes Dev. 21, 537-537 (2007).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Drosophila+eye+differentiation.">Principles of Drosophila eye differentiation.</a> Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye.">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+Ommatidium.">Cell fate in the Drosophila Ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).</li><li>Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle+and+Strabismus+form+a+functional+complex+to+generate+a+correct+axis+during+planar+cell+polarity+signaling.">Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling.</a> Embo J. 22, 4409-4409 (2003).</li><li>Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=frizzled+regulates+mirror-symmetric+pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye.</a> Development. 121, 3045-3045 (1995).</li><li>Reinke, R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interaction+in+the+Drosophila+Retina:+The+bride+of+sevenless+Gene+is+required+in+photoreceptor+cell+R8+for+R7+cell+development.">Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development.</a> Cell. 55, 321-321 (1988).</li><li>Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=strabismus,+a+novel+gene+that+regulates+tissue+polarity+and+cell+fate+decisions+in+Drosophila.">strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila.</a> Development. 125, 1149-1149 (1998).</li><li>Winter, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rho-associated+kinase+(Drok)+links+Frizzled-mediated+planar+cell+polarity+signaling+to+the+actin+cytoskeleton.">Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton.</a> Cell. 105, 81-81 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1223 (1993).</li><li>Stocker, H., Gallant, P., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-27 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שימוש תסיסנית כאורגניזם מודל, מסכי הגנטי הוביל לזיהוי של רבים מן החברים המייסדים של משפחות גנים חיוניים ביותר של מסלולי איתות שמור ביותר אאוקריוטים גבוה כולל בני אדם. מאז, בתנאי מעבדה, עין פונקציונלי הוא לוותר להישרדות, העין היא רקמה במיוחד גם מתאים הגילוי של פונקציות גן הרומן ההערכה של רשתות גנטיות. ניתוח Ultrastructural העין לטוס באמצעות השיטה המתוארת ובכך הובילו תגליות בסיסיות הרלוונטיות לפיתוח המחלה. בתחילה, ניתוח תא בודד המשובטים בוצעה באמצעות רנטגן שיבוטים המושרה בשילוב עם ידוע תאים אוטונומיים סמנים קשר הדוק רצסיבי. לאחרונה, את הזמינות של מערכת FLP / FRT כדי ליצור שיבוטים יש להקל במידה רבה את הניתוח פנוטיפי של מוטציות קטלניות בסעיפים 6,9 העין. ניתוח סעיפים העין אינה מוגבלת סעיפים משיק המתואר כאן. אם תרצה, בראש ניתן ליישר בכיוון כלשהו בתוך תבניות וחתכים רוחביים ניתן להשיג ללמוד רבדים עמוקים יותר בראש כגון lamina ואת לשד. פרוטוקול המתואר כאן הוא אפוא בשיטה תכליתי עבור ניתוח עיניים וראש מבוגרים מבני תסיסנית.

ציוד כללי: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בעלי לטוס בכלל לראות 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה מיקרוסקופ רגיל (למשל ניקון SMZ-645 זום מיקרוסקופ סטריאו), רצוי עם מקור אור הטבעת כדי למנוע הטלת צל של הידיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CO 2 כרית טוס, מכוסה בנייר Whatman 3mm כדי לספק הגנה מפני לכלוך במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מצופה לטין: להמיס הג&#39;לטין 10g ו 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O במים 1L על צלחת חימום (ומביאים לסף רתיחה, לוקח כ 2 שעות). טובלים שטף מחליק היטב (סבון) ושטף (DH 2 O) ב מחזיקי בפתרון ג&#39;לטין אוויר יבש, מכוסה בנייר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנור חימום (70 מעלות צלזיוס, תנורי ואקום הישנים ששימשו לייבוש nitrocellulose לסנן מתאימים היטב למטרה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtome מסוגל חתך Ultrathin (0.5-1 חלקים עבים מיקרומטר), כגון אלה המשמשים מתקני במיקרוסקופ אלקטרונים. אנו משתמשים Ultramicrotome MT5000 Sorvall עם סכין יהלום באיכות histo. סכינים זכוכית גם לעבוד. </li></ul> קיבוע פתרונות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 0.2 חיץ סודיום פוספט M, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן glutaraldehyde 2% חיץ 0.1M נתרן פוספט, pH 7.2 (ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות). בצע לפחות מספיק כדי 200μl לכל גנוטיפ ברצונך להטביע. שמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון אוסמיום: 2% OSO 4 במאגר 0.1M נתרן פוספט, pH 7.2. בצע רק מספיק כדי 200μl לכל גנוטיפ ברצונך להטביע, שכן הפתרון לא יכול להיות מאוחסן. שמור על הקרח. </li></ul> Glutaraldehyde OSO ו 4 הם רעילים מאוד ויש לטפל בזהירות רבה בשכונה מאוורר היטב. שימוש במסנן טיפים בעת טיפול OSO 4 למנוע השחרה של פיפטה שלך. התייבשות: הפוך 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, אתנול פתרונות 100%. מגניב רצוי 30%, 50%, אתנול 70% על הקרח לפני השימוש. מכתים פתרון: 1 Toluidine כחול ב בורקס% 1%. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th></th><th> רך </th><th> קשה </th></tr><tr><td> שרף </td><td> 54g </td><td> 50 גרם </td></tr><tr><td> Hardener B </td><td> 44.5g </td><td> 50 גרם </td></tr><tr><td> Accelerator C </td><td> 2.5G </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Plasticizer D </td><td> 10g </td><td> 0.75g </td></tr></tbody></table> טבלה 1. שרף הכנה כדי להכין את שרף, בזהירות, אך ביסודיות לערבב את כל החומרים בכוס פלסטיק באמצעות stirrer מגנטי עם בר גדול ומערבבים. הימנע בועות. לאחר aliquot, ערבוב צלוחיות scintillation סטנדרטי או מיכלים דומים להקפיא ב -20 ° C. השתמש שרף רך עבור כל היישומים אלא אם המתקן EM שלך מבקש ניסוח יותר. השתמש בכפפות לטפל שרף (מסרטנים בצורה unpolymerized שלה). כדי לפלמר שרף על ציוד ופסולת, ואופים בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך הלילה. פסולת עשוי אז להיות מושלך בבטחה וציוד לנקות ולעשות בהם שימוש חוזר. שרף unpolymerized שנשפך ניתן לנקות עם isopropanol. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> ספק </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> טוס כרית </td><td> למשל Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> סיגמא </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OSO 4 </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> דיג </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> איזמל ידיות, על # 3 </td><td> דיג </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> להבי אזמל # 11 </td><td> דיג </td><td> 08-916-5B </td></tr><tr><td> העברת pipettes </td><td> דיג </td><td> 13-711-7m </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM שרף </td><td> סיגמא (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> פלדה לנתח מחט </td><td> דיג </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM עובש הטבעה שטוח </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים מדע. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> סכיני גילוח מצופה טפלון </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים מדע. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-קצה (דגימות סטריליות) </td><td> דיג </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> שקופיות הזכוכית </td><td> דיג </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> כיסוי מחליק לא 1, 22X60 מ&quot;מ </td><td> דיג </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> לטין </td><td> דיג </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodecahydrate </td><td> סיגמא </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> היהלומים histo סכין, 6mm </td><td> Diatome בארה&quot;ב </td><td> 60 שלו </td></tr><tr><td> Toluidine כחול O </td><td> דיג </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> בורקס (Na-Tetraborate) </td><td> דיג </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX הרכבה בינונית </td><td> סיגמא </td><td> 44581-100 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2. חומרים

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

תסיסנית כבר זמן רב המשמש כמערכת מודל מחקר ופיתוח, בעיקר בשל הקלות שבה הוא ממושמע מבחינה גנטית. במהלך השנים, שפע של זנים מוטנטים וטריקים טכני פותחו כדי לאפשר שאלות מתוחכמות להישאל וענה בסכום זמן סביר. התובנה הבסיסית לתוך הגומלין של המרכיבים של כל המסלולים העיקריים ידוע איתות התקבל ב קדימה הפוכה מחקרים גנטיים תסיסנית. העין לטוס הוכיחה להיות מתאים במיוחד גם עבור ניתוח מוטציוני, שכן, בתנאי מעבדה, זבובים יכולים לשרוד בלי עיניים תפקודית. יתר על כן, פני השטח של העין חרק מורכב כ -800 עיניים יחידת הפרט (היבטים או האומטידיה) היוצרים משטח רגיל, כאשר חלקה הסתכל תחת מיקרוסקופ לנתח. לכן, קל לראות אם מוטציה עשויה להשפיע על התפתחות העין או על ידי צמיחה חיצונית מחפש אובדן השטח החלקים (פנוטיפ &quot;עין גס&quot;; איור 1.) או גודל העין הכללית, בהתאמה (עבור דוגמאות של המסכים המבוססים על מורפולוגיה עין חיצונית לראות למשל 1). לאחר ניתוחים מפורטים של פנוטיפים עין דורשים, קיבעון הטבעה פלסטיק דק חתך של העיניים הבוגרת. העין תסיסנית מפתחת מדיסק שנקרא עין דמותי, שקית לתאי האפיתל כי להתרבות להבדיל בשלבי הזחל ו גלמי (לסקירה ראה 2 למשל). כל אומטידיום מורכב 20 תאים, כולל שמונה photoreceptors (PR או R-תאים;. איור 2), ארבע עדשות מפריש תאים חרוט, תאים פיגמנט (&quot;משושה&quot; סביב מקבץ תאים R) וכן זיפים. Photoreceptors של אומטידיום כל, הכי מזוהה בקלות על ידי אברונים רגישים לאור שלהם, rhabdomeres, מאורגנים טרפז מורכב ששת &quot;החיצוני&quot; (R1-6) ושני &quot;פנימי&quot; photoreceptors (R7 / 8; R8 [איור . 2] מתחת R7 ולכן ראיתי רק בחלקים מאזורים עמוקים יותר של העין). טרפז של פן כל מיושרים במדויק עם אלה של שכנותיה הצירים anteroposterior ו dorsoventral הכוללת של העין (איור 3A). בפרט, האומטידיה של (חיצים שחורים ואדומים, בהתאמה) הגבי ו הגחון חצאים של העין הם תמונות ראי של אחד את השני מתאימות שתי צורות כיראלי הוקמה במהלך איתות הקוטביות מישוריים תא (לסקירה ראו למשל 3). השיטה לייצר חצי דקה סעיפים העין (כמו אלה שהוצגו באיור. 3) המתואר כאן הוא שונה במקצת מזו המתוארת במקור על ידי טומלינסון ו Ready 4. זה מאפשר ניתוח מורפולוגי של כל התאים פרט לתאי חרוט שקוף. בנוסף, פיגמנט של R-תאים (ראשי חץ כחול באיור. 2 ו -3) יכול לשמש כסמן התא אוטונומי עבור גנוטיפ של תא-R, דרישות הגנטי ובכך הגנים משנה של R-תאים יכולים בנקל ייקבע 5,6.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis at JoVE.com

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את הבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עיניים חתך חצי דקה ניתוח מיקרוסקופי אור מוצג כאן. הפרוטוקול ניתן להשתמש לצורך ניתוח מורפולוגי ברוטו של פגמים העין, או עם התאמות ציינו שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע דרישות הגנטי של הגנים סוגי תאים מסוימים של העין (ניתוח למשל המשובטים של קולטני האור) או לצורך ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים.

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...