Name: preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis at JoVE.com

Jag vill tacka Dr Jennifer Curtiss för bilderna i figur. 1 och Jeremy Fagan och Dr Florence Marlow för kritiskt läsa manuskriptet. Vårt arbete stöds av NIH bidrag 1R01GM088202.

1. Fly huvudet dissektion <ol><li> Kontrollera att du har allt material till hands (även gelatin belagda diabilder). Förbered glutaraldehyd och fixativ Osmium (se nedan). Per genotyp att bädda in, uppmätt 200μl lösning glutaraldehyd fixa i 1,5 ml rör på is. </li><li> Bedöva flugor på CO 2-pad (vi brukar dissekera syv flyga huvuden för att bädda in sex per genotyp i fall ett huvud förstörs under förfarandet). </li><li> Håll och lätt tryck på bröstkorgen av i farten, ryggsidan upp med pincett och använda en vass skalpell att skära av huvudet. </li><li> Stabilisera flyger huvudet genom att röra nacken med pincett och försiktigt skära bort en liten del av ett öga. Detta ökar penetrationen av fixativ (om du tänker använda ditt öga sektioner för klonat analys, skär i ögat med ingen eller mindre kloner). Undvik att röra och skadar den intakta ögat som senare kommer att sektioneras. </li><li> Tryck på huvudet med pincett eller skalpell på ytan av det avklippta ögat och överföra huvudet i glutaraldehyd / fosfat fixativ på is (chefen ofta flyter ovanpå fixativ) Den dissekerade huvuden inte bör hållas i glutaraldehyd fix längre än 15 minuter före tillsats av Osmium. Upprepa steg 1,2-1,5 med de andra flugor med samma genotyp. </li></ol> 2. Fixering och inbäddning (använd handskar för alla steg!) <ol><li> Snurra flyheads i Eppendorf centrifugera i 1 minut vid 10.000 rpm. Fortsätta även om huvudet inte sjunka. </li><li> Tillsätt 200μl för OSO 4-lösning och fixa i minst 30 minuter och upp till 1 timme på is. </li><li> Med hjälp av en pasteurpipett, ta bort glutaraldehyd / Osmium lösning (se till att använda korrekta rutiner avfallshantering!) Och ersätt med 200μl Osmium lösning. Inkubera på is i 1-6 timmar. Se alltid till att huvudena är helt täckta med vätska och aldrig ta bort all lösning som krona eller ögonen kan kollapsa! </li><li> Med hjälp av en pasteurpipett, kasta fixativ, lägga 0,5-1ml 30% etanol och inkubera i minst 5 minuter på is (se till att använda korrekta rutiner avfallshantering eftersom etanol innehåller nu Osmium!). </li><li> Upprepa ovanstående steg med 50%, 70%, (80%), 90% och två gånger 100% etanol. Inkludera 80% etanol steg om du använder ögonen för elektronmikroskopiska analys. Efter 70% tvätta steg kan proverna tas bort från isen. </li><li> Byt ut etanol med en lika stor volym propylenoxid (flyktiga, fortsätta att arbeta i huven). Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Upprepa tvätta propylenoxid. Arbeta i omgångar om bearbetningen många genotyper parallellt för att undvika att kollapsa i ögonen på grund av avdunstning av propylenoxid. </li><li> Ta bort de flesta av propylenoxid och med hjälp av en plast överföringspipett, tillsätt ca 500μl av en 1:01 harts: propylenoxid lösning. Jämvikt över natten i rumstemperatur. </li></ol> 3. Bädda och arrangemang i formar <ol><li> Se till att alla formar är märkta för att hålla reda på dina olika genotyper, fyll sedan formarna med 100% harts. Fyll inte (inga &quot;höga berg&quot; över ytan av formarna när man tittar rakt över formens yta). Använd hårt harts för EM analys. </li><li> Med hjälp av en pipett, ta bort 50% kåda från huvud, ersätt med 100% harts, och inkubera i 3-4 timmar i rumstemperatur. Som huvuden är infiltrerade med harts, kommer de att sjunka till botten av röret. </li><li> Med hjälp av en tandpetare som har drabbats på ett hårt underlag en gång för att skapa en liten krok, överföra en chef vid den tidpunkten i en form. </li><li> Placera aluminiumfolie på arbetsområdet i din dissekera möjligheter att skydda det mot kåda spill. </li><li> Med hjälp av en dissekera nål och ser om din räckvidd snurra huvudet något i harts och försiktigt flytta den till botten av formen nära den spetsiga änden. </li><li> Rikta ytan av intakt (!) Öga (eller din framtida sektionering plan om du vill ha tvärsnitt) nacken ned med främre vägg av mögel och se till att hålla tangentiella ögats yta ungefär ett halvt huvud diameter från mögel väggen. I sällsynta fall, ett öga kollapsar, som kan ses som ett tomt utrymme mellan ögats yta och huvudet nagelband. Om du har ett kollapsat öga, ersätta det med den 7: e reserv ögat. </li><li> Upprepa med alla huvuden. När detta är gjort med alla anpassningar, åter kontrollera alla ögon att se till att de inte rör sig när du tog bort nålen ur kåda. </li><li> Om du har problem med ögonen rör sig när du tar bort dissekera nålen, placera ögat som önskat, snabbt dra tillbaka nålen en aning bort från huvudet och sedan sakta ut kanylen helt. </li><li> Grädda formarna över natten vid 70 ° C. </li></ol> 4. Trimning och snittning <ol><li> Ta bort härdat kvarter från formarna genom att böja formarna, keeping koll på som blockerar motsvarar vilken genotyp (t ex förvara i små skintillationsflaskor). </li><li> För trimning, använd en chuck lämplig för ditt mikrotom som monteras med framsidan upp på ett block av plexiglas eller aluminium. Montera blocket att trimma, öga upp, i chucken. </li><li> Enligt dissektion utrymme med en teflonbelagd rakkniv bad, försiktigt skära av endast det översta lagret av block. Detta kommer att lämna en klar yta men som du bör se ögat och kan därmed förutsäga framtiden plan snittning. Undvik att skära fingrarna! </li><li> Klipp bort överflödigt plast på båda sidor av huvudet och på framsidan (dvs vad som brukade vara toppen av mögel när rikta ögonen) tills det mesta av plast runt huvudet är avskuret. Det är bäst att sakta närma sig huvudet genom att skära bort flera tunna lager av plast. </li><li> Med en ren rakblad, försiktigt bort tunna skikt från toppen av ögat i exakt planet du vill avsnitt senare (oftast tangentiellt för ögat, med en liten vinkel till den ursprungliga formen yta). </li><li> Fortsätt tills du börjar att skära bort utsidan av ögat. Kontrollera att du använder rena områden av bladet för att få ett glänsande, genomskinlig yta, vilket gör anpassningen på mikrotomen lättare. </li><li> För att spara på rakblad, använda äldre blad för råolja klippa runt sidorna av blocket och använda ett nytt blad för den fina trimningen (den första skär och 4.6). I slutändan kommer du att ha en tre sidig pyramid med en något lutande, cut-off topp som motsvarar dina framtida avsnitt plan. </li><li> Montera block i mikrotomen. Faktiska sektionering varierar beroende på vilken typ av mikrotom och kommer inte att beskrivas i detalj här. Vi använder en Sorvall MT5000 med en histo kvalitet diamant kniv för att skära 0,5 till 1μm avsnitt. För lätta mikroskopisk analys, spelar ingen roll små variationer i avsnitt tjocklek. Om sektionering kloner markeras med en vit + transgen avsnitt 1μm delar för att säkerställa att ha tillräckligt pigmentkorn intill rhabdomeres per sektion (Fig. 2). </li><li> Avsnitten kommer att flyta på vattnet. Lyft first 20-30 sektioner med en platta i slutet av ett trä Q-tips från under vattenytan i en roterande rörelse och överföra dem till en droppe vatten på en gelatin belagd glasskiva (som hålls på en värmeplatta på omkring 100 ° C ). </li><li> Upprepa med ytterligare 20-30 avsnitt. Vänta tills vattnet har avdunstat och sektioner fastna på bild. Vanligtvis delar av 3 ögon arrangerade i tre kolumner (tre ögon) genom Twp rader (övre / nedre sektioner) passar bra på en bild. </li></ol> 5. Färgning och mikroskopisk analys <ol><li> Om inte sektionering kloner, bets avsnitt. Placera bild med sektioner på en uppsättning värmeblock vid 90 ° C. Fördela Toluidine-blå färgning lösning från en 30 ml spruta kopplad till en 0.22μm filter på bilden och fläcken i 10 sekunder. Skölj genast mycket med destillerat vatten. Lufttorka. </li><li> Använd en plast överföringspipett, distribuera 3 droppar DPX monteringsmedium på bilden och täck med ett täckglas. Top med 3 Dimes och låt monteringsmedium hårdnar (t.ex. över natten vid rumstemperatur). </li><li> Bild med ett ljusmikroskop. Använd en 5x eller 10x objektivet för att hitta ett bra avsnitt och sedan byta till en 63x oljeimmersion objektiv för detaljerad analys och fotografering. Vi brukar använda inställningarna faskontrast, men mörkfält optik arbete. </li></ol> 6. Representativa resultat: Oftast är ögonen inbäddad i plast för en detaljerad analys av externa grova ögat fenotyper detekteras som en del av en genetisk skärmen eller i färd med att testa genetisk interaktion med gener som påverkar antingen allmänna ögat struktur eller polaritet. Typiska resultat av ögat avsnitt visas i figur 3. Vildtyp ommatidia (Fig. 3A) visa hela ljusmätare komplement omgiven av ett galler av pigment celler. Däremot i en skelning (stbm, aka van-gogh 7) mutant, är ommatidial polaritet förlorade och trots att hela ljusmätare komplement finns, rotation och kiralitet är randomiserade (Fig. 3B). Eftersom det stbm allelen sektioneras var aw - bakgrund, är pigmentkorn saknas i figur. 3B. Figur 3C visar ett exempel på en klonal analys. Drosophila Rho-kinas (drok) krävs för ommatidial rotation liksom för den strukturella integriteten i ögat 8. Homozygot drok 2 kloner kan identifieras genom avsaknaden av pigment i pigmentceller och rhabdomeres (vanligtvis är kloner induceras med hjälp av eyeless-FLP och ett P-element med ett starkt uttryck vit markörgen komplettera en bakgrund W - mutation i det vilda -typ och heterozygot vävnad). Det är alltså möjligt att identifiera muterade områden genom deras brist på pigment. På grund av den cell-autonomi av pigmentering i R-ceLLS tidigare nämnts kan genotyper av enskilda R-celler skall bestämmas (se pilspetsar i bild. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Drosophila ögat är ett utmärkt modellsystem för biologer sedan, i kontrast till den släta ytan av en vildtyp öga (A), är ytan av en mutant öga externt ofta grov (B), ett tecken på underliggande ögat fenotyper . I alla siffror är främre till vänster och rygg är uppe. Bilder benäget tillstånd av Dr Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Ljus mikroskopiska bilder av enstaka ommatidia sektioneras med den beskrivna metoden. Endast sju R-cellerna är synliga på en gång per ommatidium, eftersom R7 ligger på toppen av R8. (A, A &#39;) På R7 nivå är cellkroppen av R7 upptäckts mellan R1 och R6 (gul pil i en &quot;). Däremot på R8 nivå (B), är cellkroppen av R8 upptäckts mellan R1 och R2 (gul pil i B). Blå pilspetsar markerar pigmentkorn som kan användas som en cell-autonoma pigment markör. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Tangentiellt snitt genom vildtyp (A), stbm (B) och drok (C) mutant vuxna Drosophila ögon. Schema under avsnitten ange polaritet ommatidia (se (A) för pilar). Cirklarna representerar ommatidia med defekter i ljusmätare komplement. Gul linje avser rygg / ventrala rad av symmetri (ekvatorn). I motsats till den väl orienterad ommatidia av vild-typ (A), är den plana organisation förlorade i stbm mutant (B). Observera att den del av stbm muterade visat saknar pigment på grund av dess w - mutant bakgrund. (C) Eftersom drok mutationer är dödliga, måste de analyseras i kloner. Således pigmenterade celler är vildtyp eller heterozygot (fylld blå pilspetsar), medan R-celler som saknar pigment (öppen blå pilspetsar) är homozygot mutant. Förutom rotation defekter, drok mutanter visar också strukturella brister inklusive saknas eller överskott antal R-celler. Observera att för klonat analys, sektionerna inte färgas för att undvika skymmer pigmentkorn.

<ol>
	<li>Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Mst+ortholog,+hippo,+restricts+growth+and+cell+proliferation+and+promotes+apoptosis.">The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis.</a> Cell. 114, 457-457 (2003).</li><li>Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Trithorax+group+protein+Lid+is+a+trimethyl+histone+H3K4+demethylase+required+for+dMyc-induced+cell+growth.">The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth.</a> Genes Dev. 21, 537-537 (2007).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Drosophila+eye+differentiation.">Principles of Drosophila eye differentiation.</a> Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye.">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+Ommatidium.">Cell fate in the Drosophila Ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).</li><li>Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle+and+Strabismus+form+a+functional+complex+to+generate+a+correct+axis+during+planar+cell+polarity+signaling.">Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling.</a> Embo J. 22, 4409-4409 (2003).</li><li>Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=frizzled+regulates+mirror-symmetric+pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye.</a> Development. 121, 3045-3045 (1995).</li><li>Reinke, R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interaction+in+the+Drosophila+Retina:+The+bride+of+sevenless+Gene+is+required+in+photoreceptor+cell+R8+for+R7+cell+development.">Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development.</a> Cell. 55, 321-321 (1988).</li><li>Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=strabismus,+a+novel+gene+that+regulates+tissue+polarity+and+cell+fate+decisions+in+Drosophila.">strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila.</a> Development. 125, 1149-1149 (1998).</li><li>Winter, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rho-associated+kinase+(Drok)+links+Frizzled-mediated+planar+cell+polarity+signaling+to+the+actin+cytoskeleton.">Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton.</a> Cell. 105, 81-81 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1223 (1993).</li><li>Stocker, H., Gallant, P., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-27 (2008).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Att använda Drosophila som modell, genetiska skärmar lett till identifiering av många av de grundande medlemmarna av genfamiljer viktigt för de flesta av de starkt konservativa signalvägar i högre eukaryoter, inklusive människan. Sedan, under laboratorieförhållanden, är en funktionell öga umbärliga för att överleva, är ögat ett särskilt väl lämpad vävnad för upptäckten av nya genfunktioner och bedömning av genetiska nätverk. Ultrastrukturella analys av flugan ögat med hjälp av den beskrivna metoden ledde därmed till grundläggande upptäckter som är relevanta för utveckling och sjukdom. Inledningsvis var enda cell klonal analys utförs med hjälp av röntgen-inducerad kloner kombinerat med kända närstående cell-autonoma recessiv markörer. På senare tid har tillgången på FLP / FRT-systemet för att skapa kloner underlättas avsevärt fenotypisk analys av dödliga mutationer i ögat avsnitt 6,9. Analys av ögat avsnitt är inte begränsat till tangentiella avsnitt beskrivs här. Om så önskas kan huvudena anpassas i någon riktning i formarna och tvärgående sektioner kan fås att studera djupare skikt i huvudet som lamina och märgen. Protokollet som beskrivs här är alltså en mångsidig metod för analys av ögat och huvudet strukturer Drosophila vuxna.

Allmän utrustning: <ul><li> För allmänna flyga djurhållning se 10 </li><li> Standard dissektion mikroskop (t.ex. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom mikroskop), gärna med en ring ljuskälla för att förhindra en skugga av dina händer. </li><li> CO 2 Fly pad, täckt med 3MM Whatman papper för att ge skydd mot smuts under dissektionen. </li><li> Gelatin belagd diabilder: lös 10 g gelatin och 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O i 1L vatten på en värmeplatta (ta nästan till en koka, tar ca 2 timmar). Doppa väl tvättade (tvål) och sköljs (dH 2 O) glider i hållare i gelatin lösning och lufttorka täckt med folie över natten. </li><li> Uppvärmning ugn (70 ° C, gamla dammsugare ugnar som användes för nitrocellulosa filtret torka är väl lämpade för detta ändamål). </li><li> Mikrotom kan ultratunna snittning (0.5-1 ìm tjocka sektioner), t.ex. de som används av elektronmikroskopi anläggningar. Vi använder en Sorvall MT5000 Ultramicrotome med Histo kvalitet diamant kniv. Glas knivar arbetar också. </li></ul> Fixering lösningar: <ul><li> Bered en stamlösning av 0,2 M natriumfosfat buffert, pH 7,2. </li><li> Förbered 2% glutaraldehyd i 0,1 miljoner Natrium fosfatbuffert, pH 7,2 (kan lagras vid 4 ° C i 4 veckor). Gör åtminstone tillräckligt för att ha 200μl per genotyp du vill bädda in. Håll på is. </li><li> Osmium lösning: 2% Oso 4 i 0,1 miljoner natriumfosfat buffert, pH 7,2. Gör bara tillräckligt för att ha 200μl per genotyp du vill bädda in, eftersom lösningen inte kan lagras. Håll på is. </li></ul> Glutaraldehyd och OSO 4 är mycket giftiga och bör hanteras med stor försiktighet i en väl ventilerad huva. Använd filter tips vid hantering Oso 4 för att förhindra svärtning av din pipett. Dehydrering: Gör 30%, 50%, 70%, (80%), 90% och 100% lösningar etanol. Helst svalt 30%, 50%, 70% etanol på is före användning. Färgning lösning: 1% Toluidine-blå i 1% Borax. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Mjuk </th><th> Hård </th></tr><tr><td> Resin A </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Härdare B </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Accelerator C </td><td> 2,5 g </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Mjukgörare D </td><td> 10g </td><td> 0,75 g </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Resin förberedelse För att förbereda harts, försiktigt men grundligt Blanda alla ingredienser i en plastbägare med en magnetomrörare med en stor omrörare. Undvik bubblor. Efter blandning alikvot i standard skintillationsflaskor eller liknande förpackningar och frys vid -20 ° C. Använd mjuk plast för alla applikationer inte din EM anläggning frågar efter hårdare formulering. Använd handskar för att hantera harts (cancerogena i sin Opolymeriserat form). För att polymerisera harts på utrustning och avfall, baka vid 70 ° C över natten. Avfall kan då säkert kasseras och utrustning rengöras och återanvändas. Spilld Opolymeriserat harts kan rengöras med isopropanol. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Leverantör </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><td> Fly pad </td><td> t.ex. Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 x 10 ml </td></tr><tr><td> OSO 4 </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> Fisher </td><td> 04.332-1 </td></tr><tr><td> Skalpell handtag, för # 3 </td><td> Fisher </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Skalpell blad # 11 </td><td> Fisher </td><td> 08-916-5B </td></tr><tr><td> Överföringspipetter </td><td> Fisher </td><td> 13-711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM harts </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44.610-1EA </td></tr><tr><td> Stål dissekera nål </td><td> Fisher </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM platt bädda mögel </td><td> Elektronmikroskopi Sci. </td><td> 70.904-12 </td></tr><tr><td> Teflonbelagd rakblad </td><td> Elektronmikroskopi Sci. </td><td> 71.970 </td></tr><tr><td> Q-tip (sterila kompresser) </td><td> Fisher </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Glas diabilder </td><td> Fisher </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Täckglas nr 1, 22X60 mm </td><td> Fisher </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> Gelatin </td><td> Fisher </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodekahydrat </td><td> Sigma </td><td> 243.361 </td></tr><tr><td> Diamond Histo kniv, 6mm </td><td> Diatome USA </td><td> 60-Hans </td></tr><tr><td> Toluidinblått O </td><td> Fisher </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> Borax (Na-tetraborat) </td><td> Fisher </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX monteringsmedium </td><td> Sigma </td><td> 44.581-100ml </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Material

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophila har länge använts som modellsystem för att studera utvecklingen, främst på grund av den lätthet med vilken den genetiskt lätthanterlig. Under åren har en uppsjö av muterade stammar och tekniska trick tagits fram för att möjliggöra sofistikerade frågor ställas och besvaras inom rimlig tid. Grundläggande insikt i samspelet mellan komponenterna i alla kända viktiga signalvägar har erhållits framåt och bakåt genetiska Drosophila studier. Flugan ögat har visat sig vara ovanligt väl lämpad för mutationsstatus analys, eftersom, i laboratorium, kan flugor överleva utan fungerande ögon. Dessutom är ytan på insekten ögat består av cirka 800 enskild enhet ögon (facetter eller ommatidia) som bildar en regelbunden, slät yta när tittade på under ett dissekera mikroskop. Därför är det lätt att se om en mutation kan påverka ögonens utveckling och tillväxt genom externt leta efter förlusten av den släta ytan (&quot;grov öga&quot; fenotyp, Fig. 1.) Eller övergripande öga storlek, respektive (för exempel på skärmar baserade på externa ögon morfologi se t.ex. 1). Efterföljande detaljerade analyser av ögat fenotyper kräver fixering, plast bädda och tunna sektionering av vuxna ögon. Den Drosophila ögat utvecklas från den så kallade öga imaginal skiva, en påse av epitelceller att föröka sig och skilja under larver och PUPP-steg (för granskning se t ex 2). Varje ommatidium består av 20 celler, varav åtta fotoreceptorer (PR eller R-celler;. Fig. 2), fyra objektiv celler som utsöndrar kon, celler pigment (&quot;Hexagons runt R-cell kluster) och en borste. Den fotoreceptorer i varje ommatidium, lättast identifieras genom sina ljuskänsliga organeller, den rhabdomeres, är organiserade i en trapets som består av de sex &quot;yttre&quot; (R1-6) och två &quot;inre&quot; fotoreceptorer (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] under R7 och därför endast ses i sektioner från djupare delar av ögat). Den trapetsformade av varje aspekt är just i linje med de av sina grannar och det övergripande anteroposterior och dorsoventral axlar i ögat (Fig. 3A). I synnerhet ommatidia av rygg-och ventrala (svarta och röda pilar, respektive) halvorna av ögat är spegelbilder av varandra och motsvarar två kirala formerna etablerades under planar cell polaritet signalering (för granskning se t.ex. 3). Metoden att generera halv-tunna ögat sektioner (t.ex. de som presenteras i fig. 3). Beskrivs här är något modifierad från en ursprungligen beskrivs av Tomlinson och Ready 4. Det gör att morfologisk analys av alla celler utom den transparenta kon celler. Dessutom kan pigmentet av R-celler (blå pilspetsar i bild. 2 och 3) kan användas som en cell-autonoma markör för genotypen av en R-cell, och därmed genetiska kraven på gener i en delmängd av R-celler kan lätt bestämmas 5,6.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis at JoVE.com

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

En standardiserad metod för att förbereda vuxna<em&gt; Drosophila</em&gt; Ögon för semi-tunna sektionering och lätt mikroskopisk analys presenteras här. Protokollet kan användas för grov morfologisk analys av ögat defekter, eller med de angivna justeringar kan användas för att bestämma genetiska kraven för gener i specifika celltyper i ögat (t.ex. klonal analys av fotoreceptorer) eller för elektronmikroskopiska analys.

Beredning av vuxna Drosophila Ögon för Thin Sektionering och mikroskopisk analys

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Tunna Sektionering av Slice Förberedelser för Immunohistokemi

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Helcells Inspelningar från hjärnan hos vuxna Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Högupplöst video Spårning av rörelseorgan hos vuxna Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissekering av hippocampus dentate gyrus från vuxen mus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Beredning av Drosophila polytene Kromosom Squash för Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Beredning av Utveckla och vuxna Drosophila Brains och retinae för Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Beredning av Drosophila S2 celler för ljusmikroskop

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser Capture lokalt av högt rent trabekelverket från mus ögon för gen uttryck analys

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...