Name: protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro at JoVE.com

ويدعم العمل في المختبر لدينا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، وزارة الزراعة والمعهد الوطني للأغذية والزراعة ، وجبهة الخلاص الوطني ، بارد ، وزارة الطاقة ، والبنك السعودي الفرنسي لVC

1. التعبير واستخراج البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلامة بالتفاوت في البروتينات لفحصها للكشف عنها. تسمية البروتين ليكون ثبتوا على الغشاء (ProIM) مع علامة من حجم أكبر (على سبيل المثال ، ضريبة المبيعات) ، ويمكن استخدام البطاقات غير مدمجة وا?...

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis.">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li><li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein.">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li><li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton.">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li><li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus.">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li><li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants.">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li><li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus:+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication.">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li><li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit.">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li><li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability.">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li><li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANK,+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein,+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata.">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li><li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2011).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP1,+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2,+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity.">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li><li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement.">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li></ol>

هذا النهج هو مناسبة لاختبار البروتين البروتين التفاعلات بين مجموعات من البروتينات ، عندما تم تطبيقها بنجاح واحد على الأقل من البروتينات التي تذوب بسهولة في المخزن ملزمة ، ومجموعة أخرى من البروتينات 17،18. لا يمكن iInteractions بين البروتينات التي هي غير قابلة للذوبان ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> بروتين مقايسة طقم </td><td> الحيوي راد </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> بروتين مثبط الكوكتيل </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> مصغرة نظام متقلب </td><td> الحيوي RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> وشبه الجافة بغرب النشاف نظام SD electrotransfer </td><td> الحيوي RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للمفتش الأضداد مترافق مع البيروكسيداز الفجل </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> GST المضادة للأرنب الضد النسائل المتعددة </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> مكافحة strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace ، NT نقل غشاء النيتروسليلوز </td><td> بظلالها العلمية </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon الغربية الركيزة chemiluminescent HRP </td><td> ميليبور </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro

التحقق من التفاعلات بين البروتينات المختلفة أمر حيوي لتحقيق وظائفها البيولوجية على المستوى الجزيئي. هناك أساليب عدة ، سواء في التجارب المختبرية والحية ، لتقييم ملزمة البروتين ، وينبغي أن تجرى على الأقل طريقتين التي تكمل بعضها البعض أوجه القصور في الحصول على رؤى وثوقية. لمقايسة في الجسم الحي ، وتكامل ثنائي الجزيء مضان (BiFC) مقايسة يمثل النهج الأكثر شعبية والأقل الغازية التي تمكن للكشف عن البروتين البروتين التفاعل داخل الخلايا الحية ، وكذلك تحديد توطين الخلايا من 1،2 البروتينات المتفاعلة. في هذا الاختبار ، وتنصهر غير الفلورسنت N - C ومحطة GFP - نصفي أو مشتقاته للبروتينات اختبار ، وعندما يتم إحضارها بروتينات اندماج اثنين معا بسبب تفاعلات البروتينات اختبار &quot;، يتم إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت 3-6 . بسبب اشارة غير قابلة للكشف بسهولة عن طريق الفحص المجهري أو epifluorescence مبائر ، برز BiFC كأداة قوية من الاختيار بين علماء الأحياء خلية لدراسة عن بروتين تفاعلات البروتين في الخلايا الحية 3. هذا الاختبار ، ومع ذلك ، يمكن ان تنتج في بعض الأحيان إلى نتائج إيجابية كاذبة. على سبيل المثال ، يمكن تشكيل لإشارة الفلورسنت بشظايا GFP two رتبت بقدر 7 نانومتر من بعضها البعض بسبب إغلاق التعبئة والتغليف في المحفظة أ التحت خلوية صغيرة ، وأنه بدلا بسبب تفاعلات معينة 7. بسبب هذه القيود ، يجب تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من تقنيات التصوير الخلية الحية بنهج مستقل يقوم على مبدأ مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين. شارك في مناعي (المشارك IP) أو الجلوتاثيون ترانسفيراز (GST) المنسدلة المقايسات تمثل هذه الطرق البديلة التي يشيع استخدامها لتحليل التفاعلات بين البروتينات والبروتين في المختبر. ومع ذلك ، IIN هذه المقايسات ، ومع ذلك ، يجب أن تكون قابلة للذوبان البروتينات اختبارها بسهولة في المنطقة العازلة التي supportsused للتفاعل ملزمة. لذا ، لا يمكن أن تنطوي على تفاعلات معينة غير قابلة للذوبان البروتين يتم تقييمها بواسطة هذه التقنيات. هنا ، نحن لتوضيح بروتوكول للتراكب فحص غشاء بروتين ملزمة ، والتي تلتف على هذه الصعوبة. في هذه التقنية ، يمكن التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان اختبار موثوق لأنه يجمد واحد من البروتينات على مصفوفة الغشاء. هذا الأسلوب ، في تركيبة مع التجارب المجراة في مثل BiFC ، يقدم نهجا موثوق بها للتحقيق في وتوصيف التفاعلات بين البروتينات بإخلاص للذوبان وغير القابلة للذوبان. في هذه المقالة ، الربط بين فيروس موزاييك التبغ (TMV) البروتين حركة (MP) ، التي تمارس وظائف متعددة أثناء النقل الخلية الى خلية الفيروسية 8-14 ، والنباتات التي تم تحديدها مؤخرا interactor الخلوية ، والتبغ ankyrin تكرار المحتوية على البروتين (عنخ ويتجلى) 15 ، وذلك باستخدام هذه التقنية.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro at JoVE.com

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

لا غنى عن اختبار البروتين البروتين التفاعل لتشريح وظيفة البروتين. هنا ، نحن بتقديم و<em&gt; في المختبر</em&gt; البروتين البروتين فحص ملزمة ليشمل التحقيق في غشاء من البروتين ثبتوا مع بروتين قابل للذوبان. هذا الاختبار يوفر طريقة موثوق بها لاختبار التفاعل بين البروتينات غير قابلة للذوبان وبروتين في الحل.

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...