Name: protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00
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Le travail de notre laboratoire est soutenu par des subventions du NIH, Institut national de l&#39;USDA pour l&#39;alimentation et l&#39;agriculture, de la NSF, BARD, le DOE, et BSF au VC

1. Expression et l&#39;extraction des protéines <ol><li> Différentiellement tag les protéines d&#39;être testés pour leur détection. Étiquette à la protéine d&#39;être immobilisée sur la membrane (ProIM) avec une étiquette de plus grande taille (par exemple, TPS), et la balise sans fusible peut être utilisé comme un contrôle négatif immobilisé (ProIMnc). Étiquette à la protéine d&#39;être utilisé comme une sonde solubles (PROSOL) avec soit une grande ou une petite étiquette. Fusible la même ét...

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis.">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li><li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein.">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li><li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton.">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li><li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus.">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li><li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants.">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li><li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus:+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication.">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li><li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit.">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li><li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability.">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li><li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANK,+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein,+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata.">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li><li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2011).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP1,+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2,+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity.">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li><li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement.">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li></ol>

Cette approche est appropriée pour les tests interactions protéine-protéine entre les combinaisons des protéines, quand au moins un dont les protéines est facilement soluble dans le tampon de liaison, et a été appliquée avec succès à une autre combinaison de protéines 17,18. Le iInteractions entre les protéines qui sont insolubles dans ces deux conditions ne peuvent pas être testés par ce protocole. Aussi, le repliement de la réussite ProIM est critique pour le dosa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Kit de dosage de protéines </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de protéinase </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> Mini-Protean système de </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> Demi-sec western blot SD électrotransfert système de </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> Anti-IgG de lapin conjugué à la peroxydase de raifort </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-TPS de lapin d&#39;anticorps polyclonaux </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace, la membrane de nitrocellulose NT transfert </td><td> Pall scientifique </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon ouest chimioluminescence HRP substrat </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro

Validation des interactions entre différentes protéines est essentielle pour l&#39;étude de leurs fonctions biologiques au niveau moléculaire. Il existe plusieurs méthodes, à la fois in vitro et in vivo, pour évaluer la liaison aux protéines, et au moins deux méthodes qui se complètent les lacunes de l&#39;autre devrait être menée afin d&#39;obtenir des données fiables. Pour un essai in vivo, la complémentation bimoléculaires de fluorescence (BiFC) test représente l&#39;approche la plus populaire et la moins invasive qui permet de détecter les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes, ainsi que d&#39;identifier la localisation intracellulaire de l&#39;interaction des protéines 1,2. Dans cet essai, non fluorescent moitiés N-et C-terminale de la GFP ou ses variantes sont fusionnés aux protéines testées, et quand les deux protéines de fusion sont réunies en raison des interactions des protéines testées », le signal fluorescent est reconstitué 3-6 . Parce que son signal est facilement détectable par microscopie à épifluorescence ou confocale, BiFC a émergé comme un puissant outil de choix parmi les biologistes cellulaires pour étudier à propos interactions protéine-protéine dans 3 cellules vivantes. Ce test, cependant, peuvent parfois produire des résultats faux positifs. Par exemple, le signal fluorescent peut être reconstituée par deux fragments GFP réglée autant que 7 nm de l&#39;autre en raison de fermer l&#39;emballage dans un petit compartiment subcellulaire, plutôt qu&#39;en raison d&#39;interactions spécifiques 7. En raison de ces limitations, les résultats obtenus à partir des technologies d&#39;imagerie cellulaire direct doit être confirmé par une approche indépendante basée sur un principe différent pour détecter les interactions entre protéines. Co-immunoprécipitation (Co-IP) ou le glutathion transférase (GST) déroulant tests représentent ces méthodes alternatives qui sont couramment utilisées pour analyser les interactions protéine-protéine in vitro. Toutefois, dDans ces essais, cependant, les protéines doivent être testés facilement soluble dans le tampon qui supportsused pour la réaction de liaison. Par conséquent, des interactions spécifiques impliquant une protéine insoluble ne peut être évaluée par ces techniques. Ici, nous illustrons le protocole pour l&#39;essai de superposition protéine membranaire contraignant, qui contourne cette difficulté. Dans cette technique, l&#39;interaction entre les protéines solubles et insolubles peuvent être testés de manière fiable, car l&#39;une des protéines est immobilisé sur une matrice de la membrane. Cette méthode, en combinaison avec les expériences in vivo, comme BiFC, offre une approche fiable pour étudier et caractériser les interactions entre les protéines fidèlement solubles et insolubles. Dans cet article, liant entre le virus de la mosaïque du tabac (TMV) protéine de mouvement (MP), qui exerce de multiples fonctions au cours virale de cellule à cellule de transport 8-14, et un interacteur usine récemment identifié cellulaires, tabac ankyrine répétées contenant des protéines (ANK ) 15, est démontrée en utilisant cette technique.

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Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Test interaction protéine-protéine est indispensable pour la dissection de la fonctionnalité des protéines. Ici, nous introduisons une<em&gt; In vitro</em&gt; Protéine-protéine test de liaison de sonder une membrane immobilisée protéine avec une protéine soluble. Ce test fournit une méthode fiable pour tester l&#39;interaction entre une protéine insoluble et une protéine en solution.

Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l&#39;interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

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