Name: protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro at JoVE.com

Laboratuarda çalışma NIH, ABD Tarım Bakanlığı Gıda ve Tarım Ulusal Enstitüsü, NSF, BARD, Enerji Bakanlığı ve BSF VC hibe tarafından desteklenmektedir

1. İfade ve proteinlerin ekstraksiyonu <ol><li> Farklı şekillerde kendi tespiti için test edilmesi proteinler etiketi. Membran (ProIM), daha büyük boyutta (örneğin, GST) bir etiket ile immobilize ve halkaya yapışmamış etiketi hareketsiz bir negatif kontrol (ProIMnc) olarak kullanılabilir protein etiketleyin. Ya büyük ya da küçük bir etiket ile çözünebilir bir prob (ProSOL) olarak kullanılmak üzere protein etiketleyin. Aynı etiket uygun bir negatif kontrol çözünür protein (ProSOLnc) Sigorta ...

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis.">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li><li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein.">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li><li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton.">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li><li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus.">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li><li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants.">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li><li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus:+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication.">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li><li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit.">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li><li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability.">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li><li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANK,+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein,+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata.">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li><li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2011).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP1,+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2,+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity.">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li><li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement.">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li></ol>

Bu yaklaşım, proteinler en az bağlayıcı tampon kolayca çözünür olduğu ve diğer proteinlerin kombinasyonu 17,18 başarıyla uygulandı proteinler kombinasyonları arasında protein-protein etkileşimleri, test etmek için uygundur . Bu koşullar altında hem de çözünmez proteinler arasındaki iInteractions Bu protokol tarafından test edilemez. Ayrıca, başarılı refolding ProIM testi için kritik öneme sahiptir. Kalan SDS denatürasyon / Yeniden doğallaştırman?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Protein tahlil kiti </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Proteinaz inhibitörü kokteyl </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> Mini-Protean sistemi </td><td> Bio-RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> Yarı kuru western blot SD electrotransfer sistemi </td><td> Bio-RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> At turp peroksidaz ile konjuge anti-tavşan IgG </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-GST tavşan poliklonal antikor </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> Biotrace, NT nitroselüloz transferi membran </td><td> Pall Bilimsel </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon batı kemilüminesan HRP substrat </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro

Validating farklı proteinler arasındaki etkileşimleri, moleküler düzeyde kendi biyolojik fonksiyonları incelenmesi için hayati önem taşımaktadır. Proteine ​​bağlanma in vitro ve in vivo olarak değerlendirmek için, çeşitli yöntemler vardır ve birbirlerinin eksikliklerini tamamlayacak en az iki yöntem güvenilir bilgiler elde etmek için yapılmalıdır. In vivo tayininde, iki moleküllü floresan tamamlama (BiFC) tayini, canlı hücre içerisinde protein-protein etkileşimleri algılamasını sağlar en popüler ve en az invaziv bir yaklaşımı temsil ediyor, hem de etkileşen proteinler 1,2, hücre içi lokalizasyonu belirlemek için. Bu testte, GFP veya türevleri olmayan floresan K ve C-terminal yarıya iki füzyon proteinleri test proteinler &#39;etkileşimleri nedeniyle bir araya getiren ne zaman test proteinler erimiş, ve floresan sinyal 3-6 sulandırılmış. . Çünkü sinyali Epifloresans veya konfokal mikroskobu ile kolayca tespit edilebilir, BiFC hücre biyologlar arasında seçim canlı hücreler 3 protein-protein etkileşimleri hakkında eğitim için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu testte, ancak, bazen yalancı pozitif sonuç üretebilir. Örneğin, floresan sinyal daha ziyade bu spesifik etkileşimler nedeniyle 7, küçük bir hücre içi kompartmanda ambalaj yakın nedeniyle her bildiğim kadarıyla 7 nm düzenlenmiş iki GFP parçaları ile sulandırılmış olabilir. Bu sınırlamalar nedeniyle, canlı hücre görüntüleme teknolojilerinden elde edilen sonuçlar, protein etkileşimleri tespit etmek için farklı bir prensip dayalı bağımsız bir yaklaşım tarafından teyit edilmelidir. Co-immunoprecipitation (Co-IP) ya da glutatyon transferaz (GST) açılan deneyleri, in vitro protein-protein etkileşimleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılır gibi alternatif yöntemler temsil eder. Ancak, bu testlerin iin, ancak, test edilen proteinleri bağlama reaksiyon supportsused tampon kolayca çözünür olmalıdır. Bu nedenle, spesifik etkileşimler çözünmeyen bir protein içeren bu tekniklerin tarafından değerlendirilmelidir. Burada, biz bu zorluğu circumvents protein membran kaplama bağlayıcı testi için protokol göstermektedir. Bu teknikte, çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşim, bir zar matriks proteinleri biri üzerinde hareketsiz çünkü güvenilir bir şekilde test edilebilir. Bu yöntem, in vivo deneyler, bu tür BiFC ile birlikte, sadakatle çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek ve karakterize etmek için güvenilir bir yaklaşım sağlar. Bu makalede, Tütün mozaik virüsü (TMV) arasında viral hücre-hücre 8-14 taşıma sırasında birden çok işlevi uygular hareket protein (MP), ve kısa bir süre önce tanımlanmış bitki hücresel interactor, tütün ankyrin tekrar içeren protein bağlama (ANK 15), bu tekniği kullanarak gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro at JoVE.com

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir tanıtmak<em&gt; In vitro</emÇözünen bir protein ile bir zar hareketsiz protein prob&gt; protein-protein bağlayıcı tahlil. Bu testte, çözünmeyen bir protein ve çözüm bir protein arasındaki ilişkiyi test etmek için güvenilir bir yöntem sağlar.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...