Name: isolation of human islets from partially pancreatectomized patients
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients at JoVE.com

Vi vill tacka våra många kollegor som gav hjälp, råd och kritisk input i olika skeden av projektet. Produktionen av denna video artikeln stöddes med medel från det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) till den tyska Centrum för diabetesforskning (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) och Universitetssjukhuset Carl Gustav Carus vid University of Technology Dresden. Den forskning som lett till dessa resultat har erhållit finansiering från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) för initiativet för innovativa läkemedel enligt bidragsavtal nr 115.005.

1. Bukspottskörteln vävnad samlingen i operationssalen <ol><li> Kirurgen utför en partiell resektion av bukspottkörteln. </li><li> När du har placerat bukspottkörteln exemplar i en låda på is, leverera den direkt till patologen. </li></ol> 2. Tissue val för holme isolering <ol><li> Patologen väljer vävnad som verkar mjuk och frisk, behålla den skadade vävnaden i diagnostiskt syfte. Fibrotiska vävnaden och prover som erbjuder mindre än 2 g användbara vävnad är undantagna från holme isolering. </li><li> Doppa pankreas vävnad i Euro Collins lösning och leverera på is till laboratoriet. </li></ol> 3. Isolering av mänskliga holmar <ol><li> Väg bukspottkörtelns vävnad, placera det i en 10 cm parabolantenn. </li><li> Sätt 150 ml RPMI media i en 500 ml kolv. </li><li> I en 250 ml kolv, Bered lösningen matsmältningsenzymet genom att kombinera 130 ml RPMI media med 100 mg / ml DNas och 20 ml av 5mg/ml Liberase RI. Rita 10 ml av denna lösning i en spruta att injicera bukspottkörtelns vävnad. </li><li> Injicera matsmältningsenzymet lösningen i bukspottkörtelns vävnad, som syftar till att distend det jämnt. Om detta förhindras av fibros, kommer matsmältningen misslyckas troligt. Nästa, finhacka vävnaden i ~ 4 mm 3 st på is. </li></ol> 4. Mänskliga bukspottkörteln matsmältningen krets <ol><li> Montera matsmältningen kretsen som visas i Figur 1. Flödesriktningen i Ricordi kammaren är i botten och ut på toppen av kammaren. </li><li> Tillsätt resten av lösningen matsmältningsenzymet till 500 ml-kolven upp till en total volym av 300 ml och sätt i en termometer. </li><li> Överför pankreas vävnad in i kammaren, sätt i mesh (pordiameter: 600 mikrometer) och tre Kiselnitrid Marbles (diameter 15 mm), Stäng kammaren och starta pumpen med strömmen satt till 140 ml / min. </li><li> När temperaturen i kretsen når 37 ° C, starta tidtagningen och regelbundet ta prover för att avgöra när du ska sluta matsmältningen. Färgning med dithizone (2 mg / ml) ger mikroskopiska visualisering av holmar inom rötas vävnad 4. </li><li> När holmar är separerade från den omgivande acinar vävnad, snabbt stoppa matsmältningen genom att värmebatteriet på is och lägga 200 ml kall tvätt medier (900 ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) till kretsen. </li><li> Samla holmen lösning i 250 ml koniska rör som det kommer ut ur provröret. Fortsätt tills kretsen är tom. </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" /> Figur 1. Den mänskliga bukspottkörteln matsmältningen kretsen Den mänskliga bukspottkörteln matsmältningen krets inkluderar en Ricordi kammare som innehåller mesh (pordiameter: 600 mikrometer) och tre silikon kulor bornitrid (diameter 15 mm). Utflöde från kammaren drivs till vävnaden samlingen kolven med peristaltiska pumpar (140 ml / min). Pilarna anger flödesriktningen. En optimal temperatur för enzymatisk spjälkning upprätthålls genom att sänka ner värmebatteriet vid 37 ° C vattenbad. 5. Tvätt efter rötning <ol><li> Centrifugera 250 ml koniska rör som innehåller den lilla ön lösningen vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min. </li><li> Kassera supernatanten, återsuspendera holmen pelleten i tvätt medier (900 ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) och distribuera den i lika fraktioner till 50 ml koniska rör. (Valfritt:. Fördela i ytterligare koniska rör för att förbättra tvätt) Centrifugera vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min. </li><li> Kassera supernatanten och försiktigt lossa pellets genom manuell skakning. </li></ol> 6. Rening på ett Ficoll lutning <ol><li> Suspendera pelleten med Ficoll media med en densitet på 1,125 g / ml, pH 7,4 och långsamt overlay 10 ml alikvoter av Ficoll media med densitet 1,080, 1,060 och 1,037 g / ml. </li><li> Centrifugera Ficoll gradienter vid 2400 rpm, 4 ° C i 20 minuter. </li></ol> 7. Islet Insamling och kultur <ol><li> Efter centrifugering kan olika vävnader komponenter kännetecknas av deras fördelning i övertoningen. </li><li> Släng det övre lagret består av fett och bindväv. </li><li> Försiktigt skörd det första lagret av holmen aggregaten på 1,037-1,060 g / ml interfas. Detta lager innehåller de mest rena isolerade holmar. Samla fraktioner separat för effektiv isolering. </li><li> Samla den andra, mindre rena bråkdel av holmen aggregaten på 1,060-1,080 g / ml interfas. </li><li> Späd Ficoll gradienten genom att lägga till tvätt medier (900 ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) till varje koniska rör upp till en total volym på 50 ml. Centrifugera vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min. </li><li> Kassera supernatanten sugs. Var försiktig när pelleten kan sitta löst på grund av Ficoll lutning. </li><li> Tvätta pellets with tvätta media (900ml RPMI 1640 med 5,5 mM glukos och 10% FBS) och centrifugera vid 1000 rpm, 4 ° C i 5 min. Upprepa använda media holme kultur </li><li> Resuspendera holmar i kultur medier och placera dem i inkubatorn med 5% CO 2 vid 37 ° C i 24-48 timmar innan fortsatt bearbetning. </li></ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes:+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality.">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li><li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects.">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets.">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li><li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets.">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li><li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., J&#228;ger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients.">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed?.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?.</a> Diabetes Care. 31, S165-S169 (2008).</li><li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus.">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, S7-S12 (2008).</li><li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin,+GAD,+and+ICA512bdc/IA-2+autoantibodies.">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li><li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition,+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1:+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation.">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li><li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+of+Purified+{beta}-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection.">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Med vår protokollet kan mänskliga holmar isoleras från pankreas vävnad som samlats in från en partiell pancreatectomy. Framgången av detta protokoll bygger på omsorg under ett par kritiska punkter. För att bevara beta-cellviabiliteten, är det viktigt att provet transporteras snabbt på is till laboratoriet. Dessutom måste den tid vävnaden matsmältningen optimeras empiriskt beroende på kvalitet av vävnad fibros och den enzymatiska aktiviteten i media. Detta gäller även graden av mekanisk kraft appliceras manuellt till Ricordi kammaren. Alltså att få en god holme avkastning, men protokollet bäst utförs av en särskild vetenskapsman eller teknisk assistent. Inledande misslyckande är normen om inte laget är redan erfarenhet av holme isolering. Det finns viktiga skillnader mellan våra holme isolering protokoll och standardavvikelsen mänskliga holmen isolering metod: 1) Även om vi använder bukspottkörtelns vävnad utsätts för flera timmar av ischemi under det kirurgiska ingreppet är det omedelbart behandlas på plats. Detta står i kontrast till pancreata explanterade från hjärndöd givare för pankreas / ö-transplantation, som fortfarande ischemisk under flera timmar under fördelning och leverans till holmen isolering anläggningen. 2) Vi injicera kollagenas direkt i bukspottkörtelns vävnad, medan standardprotokoll är att ingjuta den i bukspottskörteln kanalen. 3) Vi separerar holmar med en diskontinuerlig Ficoll lutning istället för att samla in holmar från en kontinuerlig Ficoll övertoning med en COBE cell-processor. I de fall kirurgisk exemplaret är för fibrotiska eller knappa för att isolera ett tillräckligt antal holmar, kan vävnad fortfarande hämtas med laser capture microdissection (LCM) 10. Detta gör genuttryck uppgifter som ska återkrävas från nästan alla prov, även om den lilla ön isolering misslyckas eller avkastningen är mycket låg. Tyvärr gör producerar LCM inte levande celler för funktionella studier och deras storlek är normalt otillräcklig för proteomik analys. Sålunda kan använda LCM parallellt med våra kollagenas matsmältningen protokollet för att hämta holmarna vara det mest effektiva sättet att behandla kirurgisk exemplar. När du hämtar vävnad för holme isolering från partiella pancreatectomies är det viktigt att noga undersöka patientens anamnes och metaboliska tillstånd. En delvis pancreatectomized patienten kan drabbas av typ 3c-diabetes, dvs diabetes sekundärt till pankreas sjukdom som leder till operation 6. Bland de 43 deltagande patienter som genomgick denna operation i vår avdelning under 2010 var 32 icke-diabetiker var 5 drabbas av diabetes typ 2 och 6 hade typ 3c diabetes. Dessa data är överens med tidigare studier som pekar på försämrad glukosmetabolismen och diabetes hos en betydande andel av patienter som lider av cancer i bukspottkörteln eller kronisk pankreatit 6. Vi ansåg diabetes vara av primärt ursprung när det var diagnosen i minst ett år före debut av symtom som leder till pankreaskirurgi 7. Nivåerna av antikroppar mot holmen autoantigener bör också mätas för att utvärdera en potentiell autoimmun ursprung diabetes 8. Eftersom en patient som genomgår pancreatectomy kan lida av odiagnostiserade diabetes eller glukos intoleranta, bör alla icke-diabetespatienter ges ett muntligt prov glukostolerans före pancreatectomy 9.

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><th> Utrustning </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml serologisk pipett (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 604.181 </td></tr><tr><td> 10 ml serologisk pipett (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 607.180 </td></tr><tr><td> 25 ml serologisk pipett (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 760.180 </td></tr><tr><td> 10 ml spruta </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300.912 </td></tr><tr><td> 50 ml sprutan </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300.865 </td></tr><tr><td> 5 ml spruta </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 309.050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 Needle Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 304.622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 Needle </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 Needle Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 302.200 </td></tr><tr><td> 3 cm cellodling maträtt 2x2 mm rutnät </td><td> Nunc </td><td> 174.926 </td></tr><tr><td> 20 cm vävnadskulturer maträtt </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 353.003 </td></tr><tr><td> 6 cm Greppvänlig petriskål </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 351.016 </td></tr><tr><td> 150 ml lagring flaska </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431.175 </td></tr><tr><td> 250 ml E-kolvar </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 ml E-kolvar </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 ml skruvlock konisk botten centrifugrör </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430.776 </td></tr><tr><td> 50 ml Falcon koniska rör </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 352.070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask icke-behandlade </td><td> Nunc </td><td> 156.800 </td></tr><tr><td> Millex GV filter Duropore (0,22 mikrometer) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Bottle Top vakuumfilter (PES 70 mm i diameter Membran, 0,22 ìm porstorlek, 45 mm hals storlek, 500 ml volym) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431.118 </td></tr><tr><td> Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Snabb PES filter 0,2 ìm </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Värmebatteri </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Pump Typ PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi kammare (metallnät med 600 ìm pordiameter) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> Modell 50-U-01, Serial 0503-001 </td></tr><tr><td> Förberedelser Stand </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-ringar </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> OR-50-U-01 </td></tr><tr><td> Kiselnitrid Marbles (15 mm uppsättning av 9) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Silicon Slangar </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0 mm </td></tr><tr><td> Kirurgisk pincett </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Kirurgiska saxar (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> Vattenbad OLS 200 </td><td> Grant </td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th> Reagenser </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Kollagenas -&gt; Liberase RI (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+)-Glukos </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimetylsulfoxid (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNas Jag (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00.509 </td></tr><tr><td> Fetalt bovinserum (FBS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Fetal bovint serum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-Hydroxietyl) - 1-piperazinyl)-ethansulfons ‰ ure (HEPES) </td><td> Roth </td><td> 9105,3 </td></tr><tr><td> NaOH, 5 m </td><td> klinisk farmaci, sjukhus </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin (100x) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (express) </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 357.591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60.132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate vattenfri </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI Medium 1640 [-] D-Glukos [+] L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI Medium 1640 [+] L-glutamin </td><td> PAA Laboratories </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Media och lösningar Dithizone Lösning <ul><li> Lös upp 100 mg DTZ i 10 ml DMSO och späd med 40 ml PBS </li><li> Steril filtrera lösningen (0,22 mikrometer) </li></ul> Enzym Lösning <ul><li> Lös upp 100 RI mg Liberase i 20 ml RPMI 1640 medier (utan tillägg) </li><li> Lös upp 100 mg DNas i 1 ml RPMI 1640 medier (utan tillägg) </li><li> Steril filtrera lösningen (0,22 mikrometer) och hålla enzymet på is </li></ul> Tvätta media (1000ml/5.5mM glukos) <ul><li> Lös upp 100 ml FBS (värmeinaktiverad) </li><li> Tillsätt 450 ml RPMI 1640 (utan glukos) </li><li> Tillsätt 450 ml RPMI 1640 (11 mM glukos) </li><li> Steril filtrera lösningen (0,22 mikrometer) </li></ul> Islet odlingsmedia (500ml / 5,5 mm Glukos) <ul><li> Lös upp 10 ml 1M HEPES (pH 7,4) </li><li> Tillsätt 50 ml FBS </li><li> Tillsätt 5 ml penicillin / streptomycin (100x) </li><li> Tillsätt 2,75 ml 1 M glukoslösning </li><li> Lägg till 432,25 ml RPMI 1640 (ingen glukos) </li><li> Steril filtrera lösningen (0,22 mikrometer) </li></ul> Euro Collins Lösning <ul><li> 4083 g kalium hydrogenphosphate </li><li> 70,0 g glukos </li><li> 2237 g kaliumklorid </li><li> 14,80 g kalium monohydrogenphosphate </li><li> 1680 g natrium hydrogencarbonate </li><li> 40 ml elektrolytlösning (E 154) </li><li> pH 7,4 </li><li> Tillsätt destillerat vatten upp till 2000 ml </li><li> Steril filtrera lösningen (0,22 mikrometer) </li></ul> Ficoll stamlösning <ul><li> Tillsätt 1000 ml av Euro Collins lösning till 500 g Ficoll </li><li> Tillsätt 8,94 g HEPES </li><li> Rör över natten tills Ficoll är löst </li><li> pH 7,4 </li><li> Mät densiteten </li></ul> Ficoll Toningar <ul><li> Beräkna FBS, Euro Collins Solution och Ficoll stamlösning enligt densiteten </li><li> Kombinera 3 lösningar och mäta densiteten med en densitometer </li><li> Lägg till Euro Collins lösningen eller Ficoll stamlösning tills densitet justeras </li><li> Steril filtrera lösningen (0,22 mikrometer) och förvara vid 4 ° C </li></ul>

isolation of human islets from partially pancreatectomized patients

Utredningar om patogenesen vid typ 2 diabetes och Langerhanska öar fel 1 har hämmats av den begränsade tillgången av typ 2-diabetes holmar från organdonatorer 2. Här har vi delar våra protokoll för att isolera öar från human pankreas vävnad från typ 2-diabetes och icke-diabetiker som genomgått partiell pancreatectomy på grund av olika pankreas sjukdomar (godartade eller elakartade pankreas tumörer, kronisk pankreatit och gallgången eller duodenala tumörer) . Alla inblandade patienter gav sitt samtycke till denna studie, som också hade godkänts av den lokala etiska kommittén. Den kirurgiska prover omedelbart levereras till patolog som valde mjuk och frisk visas bukspottskörteln vävnad för holme isolering, behålla den skadade vävnaden i diagnostiskt syfte. Vi fann att för att isolera mer än 1000 öar, var vi tvungna att börja med minst 2 g bukspottkörtelns vävnad. Också viktigt att våra protokoll var att synbart distend vävnaden när du injicerar det enzym som innehåller media och därefter finhacka det för att underlätta matsmältningen genom att öka ytan. Att förlänga tillämpningen av våra protokoll till att omfatta enstaka fall där ett stort antal (&gt; 15g) av mänskliga bukspottskörteln vävnad är tillgängligt har vi använt en Ricordi kammare (50 ml) att smälta vävnaden. Under matsmältningen, skakade vi manuellt Ricordi kammare 3 vid en intensitet som varierade med prov i enlighet med sin nivå av vävnad fibros. En diskontinuerlig Ficoll gradient användes sedan för att separera holmarna från acinar vävnad. Vi konstaterade att vävnaden pellets ska vara tillräckligt liten för att vara homogent resuspenderas i Ficoll medium med en densitet på 1,125 g / ml. Efter isolering, odlade vi holmarna under stress fri förhållanden (inga skakningar eller rotation) med 5% CO 2 vid 37 ° C under minst 48 timmar för att underlätta deras funktionella återhämtningen. Utbredd tillämpning av våra protokoll och dess framtida förbättring kunde göra det möjligt att i tid skörd av stora mängder människor holmar från diabetes och kliniskt matchas utan diabetes, kraftigt framåt typ 2-diabetes forskning.

Vår protokoll gav ett genomsnitt på ~ 500 holmar per gram bukspottkörtelns vävnad, även om detta i hög grad varierar mellan preparat beror till stor del på skillnader i fibros och kollagenas aktivitet. Vi uppnådde&gt; 90% holme renhet genom att först färgning med Dithizone under vävnad bearbetning, sedan handplockar dem 24 timmar efter isolering. För att bestämma kvaliteten på den renade holmar, testade vi för 25 mm glukos-stimulerad insulinsekretion under statiska förhållanden i 2 timmar. Vi fann insulinutsöndring jämförbar med holmar från ECIT holme isolering och transplantation centra. Som holmar isolerade från delvis pancreatectomized pancreata inte är avsedda för ö-transplantation, bedömning av den totala iEQ ansågs inte vara en kritisk faktor. Viktigt är aktiverat vår metod för oss att isolera holmar för funktionella studier från 25 partiella pancreatectomized patienter mellan 2005 och 2008 5. Dessa holmar analyserades för glukos-stimulerad insulinsekretion och specifika proteinuttryck av Western blotting och immunohistokemi. Holmar isolerade från delvis pancreatecomized pancreata skulle också kunna användas för att jämföra gener och protein profiler uttryck ultrastrukturella utseende och funktionella lösningar av icke-diabetiker och diabetiker holmar. Eftersom det finns fler patienter som genomgick partiell pancreatectomy än det finns organdonatorer, kunde våra protokoll tillräckligt med prover och data ska samlas in för robust statistisk analys.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients at JoVE.com

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Utbudet av typ 2-diabetes holmar för forskningen är otillräcklig. Här har vi delar våra protokoll för att isolera holmar från patienter som genomgick partiell pancreatectomy. Detta synsätt är en unik plats för att få holmar från typ 2-diabetes och kliniskt matchas utan diabetes i tillräckligt många för grundläggande och kliniska studier.

Isolering av mänskliga Islets från Delvis Pancreatectomized Patienter

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Färgning Protokoll för mänskliga pankreatiska öar

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Förbättrad protokoll för laser mikrodissektion av humana pankreasöar från kirurgiska prover

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients

Dynamiska visuella tester för att identifiera och kvantifiera Visual skador och reparera Efter Demyelinisering i optikusneurit patienter

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

In vitro-metod för att observera E-selektin-förmedlade interaktioner mellan Prostata cirkulerande tumörceller från patienter och humana endotelceller

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Musmodell av typ 2-diabetes: Pancreatic Islet Isolering och Live-cell 2-Photon Imaging av intakt cellöar

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolering och profilering av MicroRNA innehåller exosomes från Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Full-root Aortic Valve Replacement by Stentless Aortic Xenografts in Patients with Small Aortic Roots

Full-rot Aortic Valve Replacement av stentless Aortic Xenografts hos patienter med små Aortic rötter

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering av primära mänskliga Decidual celler från foster hinnor av termen efterbörd

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...