Name: calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe at JoVE.com

Vi anerkender Silke Sachse og Beate Eisermann i udviklingen af ​​denne metode, Pablo Traversa for at trække de monteringsblok tegninger og Daniela Pelz for brug af diagrammet i figur 1. Vi er taknemmelige for Silke Sachse, Pavan Ramdya og Raphael Rytz for kommentarer til manuskriptet. R. Bell understøttes af en Boehringer Ingelheim Foundation ph.d.-stipendium. Forskning i R. Benton laboratorium er finansieret af et europæisk forskningsråd Starting Independent Researcher Grant og den schweiziske National Science Foundation.

1. Monteringsblokken Assembly <ol><li> Den plexiglas Monteringsblokken (figur 1A) skal henvises til de nøjagtige specifikationer er angivet i plan (tilgængelig fra <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) At tillade nem montering og dissektion af fluen. Tråd gennem skruerne fra bagsiden, men ikke udvide dem ud foran blokken, deres position vil blive justeret i forbindelse med udarbejdelsen af ​​dyret (se 2,7). </li><li> Ved hjælp af en præcision boremaskine, en bule gør i den øvre kant af den cirkulære kammer for fluen, graver under overfladen for at gøre plads til flue krop, hvilket reducerer tykkelsen af ​​blokken på dette tidspunkt. </li><li> Skær en kobber gitter med en skalpel vinkelret og tæt på bunden af ​​slidsen for at skabe en &quot;krave&quot;. Sørg for, at de to resulterende flapper er niveauet, da dette vil hjælpe indsættelse af fly. </li><li> Med en tandstikker, placere en lille dråbe superlim på monteringsblok over den cirkulære kammer til fluen. Placere kobber rist på limen, og position, således at spalten er centreret på blokken (figur 1A). Tryk forsigtigt ned og fjerne eventuelt overskydende lim. Med en pincet, tilsættes små dråber af lim under fligene på hver side og folde gitteret over forsiden af ​​blokken, så at spalten peger lige nedad. Sørge toppen af ​​gitteret er i niveau med blokken. Lad det tørre helt. </li><li> Saml en wire holder: skære en plastik dækglas i halve og fjerne en central brik til at gøre et &quot;U&quot; form. Brug bivoks til at lime et stykke ståltråd over toppen af ​​&quot;U&quot;, ikke gør tråden for stramt. </li><li> Konstruer antennal skjold: lave et hul i en plastik dækglas med et papir hul-punch. Trim kanter dækglas til 0,5 x 0,7 cm. Lim gennemboret plast dækglas til tape og derefter placere en dråbe af ethanol på båndet blotlagt gennem hulletfjerne klæbemiddel. </li></ol> 2. Animal Forberedelse <ol><li> Fluer af den passende genotypen - dvs bærer den ønskede kombination af &quot;driver&quot; og aktivitet-reporter transgener - bør være 1-3 uger gamle, neglebånd af yngre fluer er for blød og svære at skære. Når eksperimenter kræver direkte sammenligning af forskellige genotyper, og for at matche transgenekspression niveauer, bør fluer være aldersmatchede at undgå aldersrelaterede fysiologiske forskelle. Hvis køn ikke er vigtigt, at vi foretrækker at bruge kvindelige fluer, da de har større hoveder og er nemmere at manipulere. </li><li> Bedøve fluer ved afkøling på is. </li><li> Indførelse af en enkelt flue i monteringsblok. Hold fluen af ​​vingen leddet og skubbe det dorsale overflade først langs slidsen af ​​kobber gitteret, så at den er ophængt ved sin hals (fig. 1B-C). Hvis det er nødvendigt, drej den, indtil den ser ned. </li><li> Placer en fin kaktus ryg foran fly hoved for at forhindre det i at undslippe (fig. 1B-C). Placere kaktus rygsøjlen foran proboscis at forhindre det i at bevæge sig. Fastgør kaktus rygsøjlen til blokken ved hjælp af bivoks. At sikre, at toppen af ​​hovedet er i niveau med toppen af ​​blokken. </li><li> Fastgør hovedet af fluen til blokken med en lille dråbe af colophonium (opløst i ethanol). Placere blokken i en befugtet kasse og tillade harpiks til hærdning i ca. </li><li> Brug pincet, træk antennal pladen frem og slippe wiren på holderen (voks-side ud, se 1,5) i kutikulære folden mellem antennen og hoved. Fastgøre holderen til forsiden af ​​blokken med bivoks. </li><li> Brug skruerne indbygget i blokken, skub forsigtigt tråden indehaveren frem til at skabe noget plads mellem antennal plade og hovedet. </li><li> Anbring antennal skjoldet (se 1.6) over toppen af ​​flyve hoved med hullet placeret centralt. Fastgøres med bivoks til toppen af ​​monteringsblokken. </li><li> Ved hjælp af en kniv-splitter, cuta lille hul i båndet på skjoldet udsætte kutikula af flyve hoved bag antennen. Hullet bør ikke strække sig ud over øjnene for at forhindre præparatet i at lække. </li><li> Tætne hullet mellem båndet og kutikula med to-komponent silicium. Fjern overskydende silicium fra toppen af ​​fluen hoved. </li><li> Placere en dråbe Drosophila Ringers saltopløsning (130 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 36 mM saccharose, 5 mM HEPES, pH 7,3) på hovedet. Sørg for, at der ikke er utætheder: antennerne skal være helt tørre. Ved hjælp af en safir kniv, skåret et hul i hårstrået. Første, let score langs kutikulære fold direkte bag antennen, skæres langs øjnene og på tværs af ocelli på bagsiden. Endelig, fold det stykke af neglebånd over scorede kanten og skær fra undersiden for at undgå overskæring de antennal nerver. </li><li> Fjern forsigtigt kirtler og luftrør med fine pincet. Skylles gentagne gange med Drosophila </em&gt; Ringers, efterlader et stort fald på hovedet. </li></ol> 3. Lugt Stimulus Levering <ol><li> Lugt sprøjter: indsætte en cellulose pude i en 2 ml plastsprøjte med rene forceps og pipettespidser over på det (ved hjælp af filteret spidser) 20 ul lugt, fortyndet som ønsket i et passende opløsningsmiddel, ved hjælp af pipettespidsen til at skubbe pladen dybt ind i cylinderen . Proppen og hætten sprøjten indtil brug. Friske lugt fortyndinger skal fremstilles mindst hver 3. måned (eller oftere for meget flygtige og / eller ofte anvendte lugte), og nye puder bør være forberedt på lugt sprøjter lige før hver optagelse. Brug ikke lugt puder i mere end tre stimulering, da lugt fusionen vil henfalde. </li><li> Specialfremstillet olfaktometer (figur 2): en primær luftstrøm (1 l / min) ledes gennem teflonrør (0,4 mm indvendig diameter) 27 cm opstrøms for udgangen af ​​dette rør, en sekundær luftstrøm (1 l / min ) tilsættes. Begge luftstrømme genereres af membranpumper, ogstrømningshastigheden reguleres af to uafhængige gennemstrømningsmålere. De luftstrømme kan være befugtet ved at passere gennem vandet i gasvaskeflasker, men skal udvises forsigtighed for at undgå over-befugtning (dvs. mere end ~ 60%). Den sekundære luftstrøm ledes enten gennem en lugt sprøjte eller en tom sprøjte: sprøjter er forbundet til luftstrømmen gennem en sprøjtenål ​​(1,2 mm ydre diameter) gennemboring stemplet. En tre-vejs magnetventilen styret via en ventil controllerenhed (f.eks Harvard Apparatus VC6) anvendes til at skifte mellem den rene luft og lugt stimulus. </li></ol> 4. In vivo-billeddannelse <ol><li> Vi beskriver her billeddannelse ved hjælp af en opretstående fluorescensmikroskop (f.eks opretstående faste fase Zeiss Axio undersøgerens D1) udstyret med en 20x vand mål (f.eks Zeiss W &quot;Plan Apochromat&quot; 20x / 1,0 M27 DIC) (figur 2). Til billeddannelse med G-CAMP (excitation / emission: 488/509 nm), skal du bruge et filter blok med følgende egenskaber: 450-490 nm ekscitationsfilter, Dikroisk spejl (T495LP) og 500-550 nm emissionsfilter (Chroma ET). Anbring monteringsblokken indeholdende fluen under mikroskopet. Placer udgangen af ​​olfaktometeret ca 0,5 cm foran fluen har antennerne. </li><li> Sænk mål, indtil det rører Ringers opløsning på flue hoved. Ser gennem seeren under lysfeltbelysning, præparatet position, således at hullet i hovedet kapslen er centreret og dets grænser er i fokus. Skift til fluorescerende lys og justere fokus, indtil du kan se de mærkede neuroner (fremgår af basale grøn fluorescens af G-CAMP). </li><li> Fin fokus på glomeruli af interesse ved at erhverve billeder med en Charge-coupled device (CCD) kamera (f.eks CoolSNAP-HQ2 Digital Camera System) monteret på mikroskopet ved hjælp af egnede erhvervelse software (f.eks Metafluor) (figur 3A). Lukke membranen i belysningen lysbanen at begrænse excitationslys til det afbildede område. </li><li> Til registrering lugt-fremkaldteaktivitet, der erhvervelse til 4 Hz og justere eksponeringstid for at opnå fluorescensværdierne efter dynamiske rækkevidde CCD-kamera, men ikke lavere end 1000 (arbitrære enheder), med mindst 12-bit dynamisk opløsning. Den eksponeringstid må ikke overstige 100 ms, hvis det er muligt, at reducere G-CAMP fotoblegning. Hvis den rumlige opløsning på dit kamera tillader det, kan du øge Binning (antal brønde på chippen, der vil blive sammenflettede i en digital pixel) for at reducere eksponeringen tid. Vi opnå billeder af 350x225 pixel (med en sammenfletning af 2x2), svarende til 210x135 um i præparatet. Disse indstillinger er optimale til at fange glomerulære lugt-inducerede reaktioner i G-Camp med god rumlig og tidsmæssig opløsning og samtidig begrænse reporter blegning. </li><li> Indstil måleparametre. Vi typisk optager i 10 sekunder (dvs. 40 rammer) med lugt stimulering typisk startende 4 sekunder efter påbegyndelsen af ​​erhvervelsen periode (ramme 15) og varig anden (until rammen 19). En flue præparat normalt kan testes med op til 25-30 forskellige lugt stimuli, ofte begrænset af en irreversibel nedgang i fluorescerende signal om reporter på grund af fotoblegning. Den inter-stimulus interval vil afhænge af styrken af ​​observerede respons og hastigheden af ​​fotoblegning. Den passende længde af inter-stimulus interval for at undgå sensorisk tilpasning kan bestemmes med tilnærmelse ved gentagen præsentation af en positiv kontrol lugt (hvis kendt) i forsøg eksperimenter. Inddragelse af denne lugt hver ~ 10 stimuli i samme serie kan tillade kontrol af fortsatte levedygtighed og konsekvent lydhørhed af præparatet. </li></ol> 5. Databehandling og analyse Data er behandlet ved hjælp af ImageJ (med Mac biofotonik plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) og brugerdefinerede skriftlige programmer i Matlab og R som følger: <ol><li> Korrigere for prøve bevægelse artefakter:tilpasse alle de billeder, der svarer til en dyr forberedelse (f.eks 30 målinger af 40 frames hver) ved hjælp af &quot;stive krop&quot; mode StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg</a> ) i ImageJ. Dette trin er nødvendigt for at fjerne forskydninger i positionen af ​​de mærkede neuroner med hensyn til opnåelse ramme inden for og mellem målingerne. Imidlertid er det kun muligt at fjerne forskydninger i xy-planet. Data bør kasseres, hvis stærke ændringer i fokus forekomme. </li><li> Segment stakken i individuelle 10 sekunders (40-frame) målinger. </li><li> Korrekt til blegning af artefakter: Udsættelse for fluorescerende lys vil medføre fluorescens til at henfalde i løbet af en enkelt måling 10. I nogle tilfælde er det vigtigt at korrigere for dette henfald før analyse af data. For hver måling beregnes en baggrund ramme. Dette bør være gennemsnittet af en række billeder før stimulus debut (f.eks rammer 6-14). Dividere hver ramme i denne backgafrunde ramme til opnåelse af den relative fluorescens ændringer. Beregn den gennemsnitlige relative fluorescens for hver ramme ved at midle alle pixler inden for området mærket ved G-cAMP. Montér en dobbelt eksponentiel at den gennemsnitlige fluorescens kurve, der giver større vægt til de rammer, før stimulus og nul vægt på tidspunktet for lugt respons (20 frames efter stimulus debut i vores tilfælde). Fratræk den monterede kurven fra den relative fluorescens kurven for hver pixel. Gang de korrigerede rammer af baggrunden rammen til igen at opnå rådata. Denne form for korrektion, kan føre til en modifikation i svar dynamik Hvis signalet ikke vender tilbage til basislinien ved afslutningen af ​​målingen (fx hvis inhibitoriske eller meget stærke excitatoriske reaktioner fremkaldt) (figur 4). Medens korrektion af blegemidler artefakter er nyttig i mange tilfælde bør fortolkes tidsmæssige parametre foretages med forsigtighed, hvis et blegemiddel korrektion anvendes. </li><li> Beregne den relative ændring i fluorescens (&amp; DeLTA, F / F) for hver ramme af hver måling som (F i-F 0) / F 0 * 100, hvor F 0 er baggrunden rammen (se 5.3), og F i fluorescensen værdi for den i&#39;te ramme målingen. </li><li> Beregning af det gennemsnitlige Af / F i et cirkulært område af interesse i en glomerulus (figur 3B) med en diameter på 10 pixel for at opnå aktivitet spor (fig. 5A). Hvis det ønskes, omdanne disse spor til heatmaps anvendelse ImageJ (figur 5A). </li><li> Beregn spidsamplituden af ​​reaktionen ved at subtrahere den gennemsnitlige Af / F af fire rammer før stimulering fra middelværdien Af / F af fire rammer i toppen af ​​responset. Den samme procedure anvendes både til at illustrere rumlige responsmønstre (se figur 3B), og at kvantificere responsamplituden i specifikke områder af interesse på tværs fluer (se figur 5B). Spidsresponsen kan også kvantificeres ved at integrere arealet under kurven i tid af stimulus, eller averaging rammerne omkring maksimum af respons. </li></ol> 6. Repræsentative resultater Vi anvendte protokoller ovenfor for at registrere og analysere propionsyre-fremkaldte reaktioner fluer, der udtrykker G-CaMP1.6 28 under kontrol af promotoren for det olfaktoriske coreceptoren IR8a, som er aktiv i forskellige populationer af OSN 29,30 ( figurerne 3-5). Stimulering med 1% propionsyre fremkalder stigninger i G-cAMP fluorescens - indikerer stigninger i intracellulært calcium - i OSN innerverer to glomeruli, DC4 og DP1l (figur 3B). Vi viser forskellige måder at repræsentere data fra flere fluer i figur 5: line aktivitet spor, heatmaps og en bar plot af den maksimale respons. Propionsyre-fremkaldt reaktioner har forskellige spidsamplituder og tidsmæssige dynamik i DC4 og DP1l. Selv om svarene er generelt robuste, kan variation mellem de enkelte dyr også ses i både glomeruli (se hanatmaps i figur 5A). Kvantificering af de maksimale responser (figur 5B) tillader en simpel statistisk sammenligning mellem forskellige glomeruli og forskellige duftstoffer tværs dyr. Dog kan lugt-fremkaldte calcium reaktioner har ikke-ensartede tidsmæssige dynamik, og kvantificere deres størrelse med en enkelt værdi vil se bort fra denne kompleksitet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> Figur 1. Skematisk af monteringsblokken (A) før og (B) efter indføring af flue, og (C) et topbillede i nærbillede (tilpasset fra 31). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> Figur 2. Skematisk af den eksperimentelle opsætning. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> Figur 3 (a) set fra oven flue præparatet efter trin 2.8 (venstre panel) og rå fluorescens billede af antennal lapper mærket med G-CaMP1.6 (Genotype: IR8a promotor: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 og DP1l glomeruli kan skelnes ved deres morfologi, størrelse og position og er markeret med rød og blå, hhv. (B) Farvekodede billede af respons på propionsyre (1% v / v). Billedet svarer til bf / F af top af reaktionen beregnet som beskrevet i trin 5.6 (se også figur 5A). Den colorscale venstre angiver% Af / F-værdi. De sorte cirkler angiver positionen og størrelsen af ​​området af interesse anvendes til at kvantificere de responser (se figur 5). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> Figur 4. Korrigering blegning af fluorescerende reporter-signalet. Eksempler på virkningen af ​​blegemiddel korrektion som beskrevet i trin 5.3 Prøvedata til venstre panel kan korrigeres, uden væsentlige ændringer i formen af ​​indsatsen. Sample data på højre panel er alvorligt påvirkered af blegemiddel korrektion, sandsynligvis fordi signalet falder og holdes under baseline efter lugt stimulus ophør. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> Figur 5 (A) Top. Temporale dynamik calcium reaktioner glomeruli DC4 (venstre) og DP1l (højre) propionsyre (1% v / v). De sorte spor viser medianen af ​​den gennemsnitlige bf / F i regionen af ​​interesse (se figur 3B) på tværs af otte dyr. Den grå overflade angiver området mellem den første og tredje kvartil af fordelingen. Præsentation af median og kvartil værdier giver flere oplysninger om variabilitet og distribution af observerede respons end middelværdien og standardfejlen. De grønne og magenta bokse angiver rammer gennemsnit til at beregne de maksimale responser vist i figur 3B, og kvantificeres på figur 5B. Nederst: De heatmaps viser svardataene for alle de enkelte dyr i separate rækker, med bf / F-værdier Represented af colorscale (yderst til højre). De vandrette sorte streger angiver tid og varigheden af ​​stimulus. (B) medianen for maksimum reaktioner på propionsyre på tværs af otte dyr for DC4 og DP1l glomeruli. Fejlsøjlerne angiver området mellem første og tredje kvartil af fordelingen.

<ol>
	<li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+olfactory+systems+in+insects:+anatomy+and+function.">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li><li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila.">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li><li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+olfactory+processing.">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li><li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+information+processing+in+Drosophila.">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li><li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe:+new+developments.">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li><li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain.">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li><li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes.">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li><li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain.">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li><li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+Ca2++dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones.">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li><li>Galizia, C. G., Vetter, R. S., Christensen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). 13, 349-392 (2005).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca&#40;2+&#41;+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca&#40;2+&#41; probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li><li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release.">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li><li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception.">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+system+:+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes.">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system.">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+System:+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression,+Lineage+Tracing,+and+Mosaic+Analysis.">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li><li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons.">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Fremstilling og analyse her beskrevne metoder kan anvendes til at analysere lugt-fremkaldte reaktioner i en population af neuroner i antennal lap (OSN, LN og PNS), hvor en tilsvarende driver transgen er tilgængelig. Mens vi beskriver anvendelsen anvendelse af et fluorescensmikroskop, kan optisk billeddannelse af dette præparat ligeledes udføres ved anvendelse af konfokal eller to-foton mikroskopi 22,32. Faktisk sidstnævnte instrumenter afhjælpe lys-spredning problem bredt felt mikroskopi, hvilket kan reducere opløsningen på billederne, især når et stort antal neuroner udtrykker reporter. Dette præparat normalt tillader optagelser af lugt-fremkaldt reaktioner i mindst en halv time, men denne gang kan være betydeligt længere eller kortere afhængigt af antallet og længden af ​​registrerede målinger, eksponering tid, der anvendes for hver ramme og den inter-stimulus interval. Endvidere kan to-foton excitering reducere fotoblegning af den fluorescerende reporter, såvel som cellulære fototoksicitet, for at tillade måling over længere tidsperioder 22,32. Uanset valget af mikroskopet, bevægelse af flue hjernen i hovedet kapslen er den hyppigst forekommende problem, når billeddannelse i intakte dyr. Mens bevægelse korrektion kan rette mindre problemer (trin 5,1), er det normalt bedre kun at optage fra meget stabile præparater. Strategier for at reducere bevægelse artefakter omfatter: (i) korrekt begrænse de snabel af fluen med kaktus rygsøjlen, (ii) at immobilisere flyve ben ved at fastgøre dem til scenen med eicosan (før trin 2,6) (eicosan kan smeltes på ~ 37 ° C; bruge en sølvtråd at udvide og forfine spidsen af ​​loddekolben til dette formål), (iii) huldannelse spiserøret (synlige mellem antennal nerver) med fine pincet. Ud over G-CaMP1.6 anvendes her, er en række af optimerede versioner af G-cAMP og andre calcium indikatorer rådighed,der afviger i deres signal-støjforhold, basisliniefluorescensen og tidsmæssige dynamik 12,28,33. Den præcise Valget af sensor bør tage hensyn til alle disse egenskaber, typen af ​​neuroner, der skal analyseres, og den biologiske spørgsmål, der behandles. Strømsensorer rapporterer calcium ændringer, der korrelerer ret godt med action potentialer 12,34, og deres yderligere forbedring, kombineret med et stigende antal specifikke genetiske driver linjer 35 vil fortsætte med at øge potentialet i optiske billeddannelse af neurale aktivitet i intakte fly.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Leverandør </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Cactus rygsøjlen </td><td> Havecenter </td><td></td><td> ~ 7mm lange tynde, ikke for fleksible </td></tr><tr><td> Rosin </td><td> String instrument butik </td><td></td><td></td></tr><tr><td> To komponent silicium </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Skræddersyet plexiglas monteringsblok </td><td> Tegninger tilgængelige fra <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kobber net </td><td> Athene Gitre </td><td> G220-5 </td><td> Normalt anvendes til elektronmikroskopi prøver. </td></tr><tr><td> Skruer </td><td> Hardware butik </td&gt; <td></td><td> 2 mm i diameter </td></tr><tr><td> Plastic dækglas </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Loddekolber tips </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Reguleret strømforsyning </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Tynd wire </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosan </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Køb software </td></tr><tr><td> Monochromator </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Skrøbelig vinger </td><td> Gode ​​Science Tools </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Holder til kniv </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire kniv </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Tveægget klinge 1mm </td></tr><tr><td> Membran benzinpumper </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Safir bladholder </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Tre vejs ventil </td><td> Lee Company </td><td> LFAA1200118H </td><td> Konfiguration E </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Bivoks </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulose pad </td><td> Kettenbach Medicinsk </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pincet </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologi # 5 </td></tr><tr><td> Sprøjter </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2 ml, Discardit II 2pieces </td></tr><tr><td> Needles </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

Den antennal lap er den primære olfaktoriske center i insektet hjernen og repræsenterer anatomiske og funktionel ækvivalent af hvirveldyr lugtekolben 1-5. Lugtesansen oplysninger i den ydre verden overføres til antennal lap af olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN), der skiller til forskellige regioner i neuropil kaldet glomeruli i henhold til den specifikke olfaktoriske receptoren de udtrykker. Her kan OSN axoner synapse med både lokale interneuroner (LMS), hvor processer innerverer mange forskellige glomeruli og projektionsskærme neuroner (PNS), der bibringer olfaktoriske information højere olfaktoriske hjerneregioner. Optisk billeddannelse af aktiviteten af ​​OSN, LNS og PNS i antennal lap - traditionelt under anvendelse af syntetiske calcium indikatorer (fx calcium grøn, fura-2) eller spændingsfølsomme farvestoffer (fx RH414) - har længe været en vigtig teknik at forstå, hvordan olfaktorisk stimuli er repræsenteret som rumlige og tidslige mønstreaf glomerulær aktivitet i mange arter af insekter 6-10. Udvikling af genetisk kodede neurale aktivitet reportere, såsom fluorescerende calciumindikatorer G-Camp 11,12 og Cameleon 13, bioluminescerende calciumindikator GFP-aequorin 14,15, eller en reporter af synaptisk transmission, er synapto-pHluorin 16 gjorde olfaktoriske system bananflue, Drosophila melanogaster, specielt tilgængelige for neurofysiologisk billedbehandling, supplerer dens omfattende beskrevne molekylære, elektrofysiologiske og neuroanatomiske egenskaber 2,4,17. Disse journalister kan selektivt udtrykkes via binære transkriptionelle kontrolsystemer (f.eks GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q-system 21) i definerede populationer af neuroner i olfaktoriske kredsløb til at dissekere med høj rumlig og tidsmæssig opløsning hvordan lugt-fremkaldte neurale aktivitet er repræsenteret, moduleret og forvandlede 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Her beskriver vi de forberedelse og analysemetoder til at måle lugt-fremkaldte reaktioner i Drosophila antennal lap med G-CAMP 25-27. Dyret præparat er minimalt invasiv og kan tilpasses til billeddannelse med bredt synsfelt fluorescens, konfokal og to-foton mikroskoper.

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe at JoVE.com

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Beskriver vi en etableret teknik til at måle og analysere lugt-fremkaldte calcium responser i antennal lap af levende<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Calcium Imaging af lugt-fremkaldte reaktioner i Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Imaging Lugt-Evoked Aktiviteter i musen lugtekolben bruger optisk reflektans og autofluorescens signaler

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging Neuronal Svar på Slice Varer af Vomeronasal Organ udtryk for en genetisk kodet Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Identifikation af olfaktoriske Flygtige stoffer ved hjælp af gaskromatografi-Multi-unit Recordings (GCMR) i Insect Antennal Lobe

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo optisk calcium billeddannelse af indlærings induceret synaptisk plasticitet i Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Kultur af Brain Kapillære Pericytes for cytosolic calcium målinger og calcium Imaging Undersøgelser

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo Calcium Imaging af Mus Geniculate Ganglion Neuron Svar på Smag Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Calciumbilleddannelse i mus overlegen colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...