Name: calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe at JoVE.com

Vi erkjenner Silke Sachse og Beate Eisermann i utviklingen av denne metodikken, Pablo Traversa for tegning montering blokken plantegninger og Daniela Pelz for bruk av skjematisk i figur 1. Vi er takknemlige til Silke Sachse, Pavan Ramdya og Raphael Rytz for kommentarer til manuskriptet. R. Bell er støttet av en Boehringer Ingelheim Foundation PhD Fellowship. Forskning i R. Benton laboratorium er finansiert av et europeisk forskningsråd Starting Independent Researcher Grant og den sveitsiske National Science Foundation.

1. Montering Block Assembly <ol><li> Den plexiglass montering blokk (figur 1A) bør gjøres til de nøyaktige spesifikasjonene i blåkopi (tilgjengelig fra <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) For å tillate enkel montering og disseksjon av flua. Tråden gjennom skruene fra baksiden, men ikke utvide dem utover foran blokka, deres posisjon vil bli justert under forberedelsen av dyret (se 2.7). </li><li> Ved hjelp av en presisjon drill, lage en bulk i den øvre grensen av det runde kammeret for flua, grave under overflaten for å gjøre plass til flua kropp, redusere tykkelsen på blokken på dette punktet. </li><li> Skjær en kobber rutenett med en skalpell vinkelrett og nær bunnen av sprekken for å lage en &quot;krage&quot;. Pass på de to resulterende flaps er nivå, da dette vil bidra til innsetting av flua. </li><li> Med en tannpirker, plasserer en liten dråpe superlim på montering blokken over sirkulær kammeret for flua. Plasser kobber rutenettet på lim og posisjon slik at sprekken er sentrert på blokken (figur 1A). Trykk forsiktig ned og fjerne overflødig lim. Med en pinsett, legge små dråper lim under klaffer på hver side og brett rutenett over fronten av blokken slik at splitten peker rett nedover. Pass på toppen av rutenettet er på nivå med blokken. La det tørke helt. </li><li> Sett sammen en wire holder: klippe en plast dekkglass i to og fjerne en sentral brikke for å lage en &quot;U&quot;-form. Bruk bivoks å lime et stykke ledning over toppen av &quot;U&quot;, gjør ikke ledningen altfor stram. </li><li> Konstruer antennal skjold: lage et hull i en plastpose dekkglass med en papir hulling. Trim kantene på dekkglass til 0,5 x 0,7 cm. Lim gjennomboret plast dekkglass å tape, og deretter plassere en dråpe av etanol på tapen eksponert gjennom hullet tilfjerne limet. </li></ol> 2. Animal Forberedelse <ol><li> Fluer riktig genotype - dvs. bærer ønsket kombinasjon av &quot;driver&quot; og aktivitet-reporter transgener - bør være 1-3 uker gammel, skjellaget av yngre fluer er for myk og vanskelig å skjære. Når eksperimentene krever direkte sammenligning av ulike genotyper, og for å matche transgenet uttrykk nivåer, bør fluene være alders-matchet å unngå aldersrelaterte fysiologiske forskjeller. Hvis kjønn ikke er viktig, foretrekker vi å bruke kvinnelige fluer siden de har større hoder og er lettere å manipulere. </li><li> Anesthetize fluer ved nedkjøling på is. </li><li> Innføre en enkel flue i montering blokken. Hold flua ved vingen felles og skyv det, dorsal overflaten først, langs splitten i kobber nettet slik at den blir suspendert av sin hals (Figur 1B-C). Hvis nødvendig, roter det til det ser ned. </li><li> Plasser en fin kaktus ryggraden foran fly hode for å hindre at den rømmer (Figur 1B-C). Plasser kaktus ryggraden foran snabel for å hindre den fra å flytte. Fest kaktus ryggraden til blokken ved hjelp av bivoks. Pass på at toppen av hodet er på nivå med toppen av blokken. </li><li> Fest hodet på flua til blokken med en liten dråpe rosin (oppløst i etanol). Plasser blokken i en fuktet boks og la harpiks for å herde i ca en time. </li><li> Ved hjelp av tang, dra antennal platen frem og slippe ledningen på holderen (voks-side ut, se 1.5) i cuticular fold mellom antennen og hode. Fest holderen til forsiden av blokken med bivoks. </li><li> Bruk skruene innebygd i blokken, skyv ledningen innehaver frem til å lage litt plass mellom antennal plate og hodet. </li><li> Plasser antennal skjold (se 1.6) over toppen av flua hode med hullet plassert sentralt. Fest med bivoks til toppen av montering blokken. </li><li> Ved hjelp av en kniv-splitter, CuTA lite hull i tapen på skjoldet utsette skjellaget på flua hode bak antennen. Hullet bør ikke strekke seg utover øynene for å forhindre forberedelsen lekker. </li><li> Tett hullet mellom tape og skjellaget med to-komponent silisium. Fjern overflødig silisium fra toppen av flua hode. </li><li> Plasser en dråpe Drosophila Ringer saltvannsoppløsning (130 mM NaCl, 5 mm KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 36 mm sakkarose, 5 mm HEPES, pH 7,3) på hodet. Kontroller at det ikke er noen lekkasjer: antennene bør forbli helt tørt. Ved hjelp av en safir blad, skar et hull i skjellaget. Først lett poengsummen langs cuticular fold rett bak antennen, og deretter klippe langs øynene og over Ocelli på baksiden. Til slutt, brett stykke skjellaget over scoret kanten og skjære fra undersiden for å unngå kutte de antennal nervene. </li><li> Fjern forsiktig kjertler og luftrør med fine pinsett. Skyll gjentatte ganger med Drosophila </em&gt; Ringer, etterlot seg en stor dråpe på hodet. </li></ol> 3. Lukt Stimulus Levering <ol><li> Lukt sprøyter: Sett en cellulose pute i en 2 ml plastsprøyte med rene pinsett og pipette på det (ved hjelp av filter tips) 20 mL av lukt, utvannet som ønsket i en passende løsemiddel, ved hjelp av pipettespissen å skyve puten dypt inn i tønne . Plugg og lue sprøyten inntil nødvendig. Frisk lukt fortynninger bør utarbeides minst hver 3. måned (eller oftere for svært flyktige og / eller ofte-brukt lukt), og nye puter bør være forberedt på lukt sprøyter rett før hvert opptak. Ikke bruk lukt pads for mer enn tre stimuleringer, ettersom lukt konsentrasjonen kunne forfalle. </li><li> Custom-made olfactometer (figur 2): en primær luftstrømmen (1 l / min) er rettet gjennom Teflon tubing (0,4 mm innvendig diameter); 27 cm oppstrøms utløpet av dette røret, en sekundær luftstrømmen (1 l / min ) er lagt til. Begge luftstrømmer genereres av membran pumper, ogstrømningshastigheten er regulert av to uavhengige strømningsmålere. De luftstrømmer kan være fuktet ved å passere gjennom vann i gass vaske flasker, men forsiktighet bør utvises for å unngå over-luftfukting (dvs. mer enn ~ 60%). Den sekundære luftstrømmen er rettet enten gjennom en lukt sprøyte eller en tom sprøyte: sprøyter er koblet til luftstrømmen gjennom en kanyle (1,2 mm ytre diameter) piercing stempelet. En tre-veis magnetventil styres via en ventil kontrollerenhet (f.eks Harvard Apparater VC6) brukes til å veksle mellom ren luft og lukt stimulans. </li></ol> 4. In vivo avbildning <ol><li> Vi beskriver her bildebehandling ved hjelp av en oppreist fluorescerende mikroskop (f.eks stående fast Stage Zeiss Axio Kontrol D1) utstyrt med en 20x vann objektiv (f.eks Zeiss W &quot;Plan-Apochromat&quot; 20x / 1,0 M27 DIC) (figur 2). For bildebehandling med G-camp (eksitasjon / utslipp: 488/509 nm), bruke et filter blokk med følgende egenskaper: 450-490 nm eksitasjon filter, Dichroic speil (T495LP) og 500-550 nm utslipp filter (Chroma ET). Plasser montering blokken inneholder flua under mikroskopet. Plasser avkjørselen til olfactometer ca 0,5 cm i fronten på flua i antennene. </li><li> Senk målet til den berører Ringers løsning på direkten hode. Ser gjennom visningen under lyse-feltet belysning, plassering forberedelsene slik at hullet i hodet kapselen er sentrert og dens grenser er i fokus. Bytt til fluorescerende lys og justere fokus til du kan se de merkede nevroner (tilsynelatende fra basal grønn fluorescens av G-camp). </li><li> Fin fokus på glomeruli av interesse ved å kjøpe bilder med en Charge-coupled device (CCD) kamera (f.eks CoolSNAP-HQ2 Digital Camera System) montert på mikroskopet ved hjelp av egnet kjøp programvare (f.eks Metafluor) (figur 3A). Lukk membranen i belysning lysbanen å begrense magnetisering lys til avbildes området. </li><li> For opptak lukt-genererteaktivitet, setter oppkjøpet satsen til 4 Hz og justere eksponeringen tid til å skaffe fluorescens verdier innenfor den dynamiske rekkevidden av CCD kamera, men ikke lavere enn 1000 (vilkårlige enheter), med minst 12-bits dynamisk oppløsning. Eksponeringstiden bør ikke overskride 100 ms, om mulig, å redusere G-camp fotobleking. Dersom romlig oppløsning på kameraet ditt tillater det, kan du øke Binning (antall brønner på brikken som skal binned til en digital piksel) for å redusere eksponeringen tid. Vi får bilder av 350x225 piksler (med en Binning av 2x2), tilsvarende 210x135 mikrometer ved forberedelse. Disse innstillingene er optimalt å fange glomerulære lukt-induserte reaksjoner fra G-camp med god romlig og tidsmessig oppløsning samtidig som den begrenser reporter bleking. </li><li> Still måleparametere. Vi vanligvis opp i 10 sekunder (dvs. 40 rammer), med lukt stimulering vanligvis starter 4 sekunder etter begynnelsen av oppkjøpet perioden (ramme 15) og varig en andre (until ramme 19). En flue forberedelse kan normalt testes med opptil 25-30 forskjellige lukt stimuli, ofte begrenset av en irreversibel nedgang i fluorescerende signal om reporteren grunn photobleaching. Den inter-stimulus intervall vil avhenge av styrken av responsen observert og hastigheten av photobleaching. Den passende lengde inter-stimulus intervall for å unngå sensorisk tilpasning kan bestemmes omtrent ved gjentatt presentasjon av en positiv kontroll lukt (hvis kjent) i rettssaken eksperimenter. Inkludering av denne lukt hvert ~ 10 stimuli i en gitt serie kan tillate verifisering av fortsatt levedyktighet og konsistent respons av preparatet. </li></ol> 5. Data Processing og analyse Data behandlet ved hjelp ImageJ (med Mac Biophotonics plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) og egendefinerte skriftlige programmer i Matlab og R som følger: <ol><li> Rett etter prøven bevegelse gjenstander:justere alle bildene tilsvarer en dyr forberedelser (f.eks 30 mål på 40 rammer hver) med &quot;stive kroppen&quot; modus av StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg</a> ) i ImageJ. Dette trinnet er nødvendig for å fjerne skift i plasseringen av merket nevroner med hensyn til anskaffelse rammen innenfor og mellom målingene. Det er imidlertid bare mulig å fjerne skift i xy planet. Data skal kastes dersom sterke endringer i fokus forekomme. </li><li> Segment stabelen i individuelle 10-sekunders (40-ramme) målinger. </li><li> Riktig for bleking gjenstander: Eksponering for fluorescerende lys vil føre til fluorescens å forfalle i løpet av en enkelt måling 10. I noen tilfeller er det viktig å korrigere for dette forfallet før analysere dataene. For hver måling kalkulere en bakgrunn ramme. Dette bør være gjennomsnittet av flere rammer før stimulus onset (f.eks rammer 6-14). Dele hver ramme av denne backgrunde ramme for å oppnå de relative fluorescens endringene. Beregn middelverdien relative fluorescens verdi for hver ramme ved gjennomsnitt alle piksler innenfor området merket med G-camp. Monter en dobbel eksponentiell til gjennomsnittet fluorescens kurve, noe som gir sterkere vekt på rammene før den stimulans og null vekt på tiden av lukt respons (20 bilder etter stimulans utbruddet i vårt tilfelle). Trekk det monterte kurven fra den relative fluorescens kurve for hver piksel. Multipliser de korrigerte rammer av bakgrunnen rammen til re-skaffe rådata. Denne typen korreksjon kan føre til en endring i responsen dynamikk hvis signalet ikke går tilbake til grunnlinjen innen utgangen av målingen (f.eks hvis hemmende eller veldig sterk eksitatoriske responser fremkalt) (figur 4). Mens korrigering av bleking artefakter er nyttig i mange tilfeller bør tolkning av verdslige parametere gjøres med forsiktighet hvis et blekemiddel korreksjon brukes. </li><li> Beregn den relative endringen i fluorescens (&amp; Delta; F / F) for hver ramme av hver måling som (F i-F 0) / F 0 * 100, hvor F 0 er bakgrunnen rammen (se 5.3), og F i fluorescens verdien for jeg th rammen av målingen. </li><li> Beregn gjennomsnittlig ΔF / F innenfor et sirkulært område av interesse i en glomerulus (Figur 3B) med en diameter på 10 piksler for å skaffe aktivitet spor (Figur 5A). Hvis ønskelig, transformere disse sporene til heatmaps bruker ImageJ (Figur 5A). </li><li> Beregn topp amplitude av responsen ved å trekke gjennomsnittet ΔF / F av fire bilder før stimulering fra den midlere ΔF / F av fire bilder i løpet av midten av responsen. Samme fremgangsmåte brukes både for å illustrere romlige reaksjonsmønstrene (se figur 3B) og å tallfeste responsen amplituden i bestemte regioner av interesse på tvers av fluer (se figur 5B). Toppen responsen kan også kvantifiseres ved å integrere arealet under kurven i den tiden av stimulus, eller averaging rammene rundt det maksimale av responsen. </li></ol> 6. Representative Resultater Vi brukte protokollene over for å registrere og analysere propionsyre-evoked responser fluer uttrykker G-CaMP1.6 28 under kontroll av arrangøren for olfactory co-reseptor IR8a, som er aktiv i flere forskjellige populasjoner av OSNs 29,30 ( Tall 3-5). Stimulering med 1% propionsyre utløser økning i G-camp fluorescens - indikerer en økning i intracellulær kalsium - i OSNs innervating to glomeruli, DC4 og DP1l (Figur 3B). Vi illustrerer ulike måter å representere data fra flere fluer i Figur 5: Linje aktivitet spor og heatmaps og en bar tomt av peak svar. Propionsyre-evoked responser har forskjellige peak amplituder og tidsmessige dynamikken i DC4 og DP1l. Dessuten, selv om svarene er generelt robuste, kan variasjon mellom individer også være observert i både glomeruli (se hanatmaps i Figur 5A). Kvantifisering av peak svar (Figur 5B) tillater en enkel statistisk sammenligning mellom ulike glomeruli og ulike odorants tvers dyr. Imidlertid kan luktfrie evoked kalsium svarene har ikke-uniform timelige dynamikk, og kvantifisering deres magnitude med en enkelt verdi vil se bort fra denne kompleksiteten. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk av montering blokk (A) før og (B) etter innføringen av flua, og (C) en topp utsikt i nærbilde (tilpasset fra 31). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> Figur 2. Skjematisk av den eksperimentelle oppsett. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> Figur 3. (A) Top visning av flua preparatet etter trinn 2.8 (venstre panel) og rå fluorescens bilde av antennal lobes merket med G-CaMP1.6 (Genotype: IR8a promoter: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 og DP1l glomeruli kan være preget av deres morfologi, størrelse og posisjon og er merket i rødt og blått, henholdsvis. (B) Fargekodede bilde av responsen til propionsyre (1% v / v). Bildet tilsvarer ΔF / F for toppen av responsen beregnes som forklart i trinn 5.6 (se også figur 5A). Den colorscale på venstre angir% ΔF / F verdi. De svarte sirklene viser plasseringen og størrelsen på regionen av interesse brukes til å kvantifisere svarene (se figur 5). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> Figur 4. Korrigere bleking av fluorescerende reporter signal. Eksempler på effekten av blekemiddel korreksjon som beskrevet i trinn 5.3. Eksempeldata på venstre panel kan korrigeres uten store endringer i form av responsen. Eksempeldata på høyre panelet påvirke alvorliged av blekemiddel korreksjon, sannsynligvis fordi signalet synker og blir vedlikeholdt under grunnlinjen etter lukt stimulans avslutning. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> Figur 5 (A) Topp:. Timelige dynamikk av kalsium svarene av glomeruli DC4 (til venstre) og DP1l (høyre) til propionsyre (1% v / v). De svarte sporene viser medianen av middelverdien ΔF / F innenfor regionen av interesse (se Figur 3B) over åtte dyr. Den grå flaten viser området mellom første og tredje kvartiler av distribusjonen. Presentasjon av median og kvartil verdier gir mer informasjon om variabilitet og distribusjon av observerte responser enn gjennomsnittet og standardavviket. De grønne og magenta boksene indikerer rammene i gjennomsnitt til å beregne topper svarene som er vist i Figur 3B, og kvantifisert i figur 5B. Nederst: heatmaps viser svardatene for alle individuelle dyr i separate rader, med ΔF / F verdier Represented av colorscale (helt til høyre). De horisontale svarte striper angir tidspunkt og varighet av stimulans. (B) Median for maksimal respons på propionsyre over åtte dyr for DC4 og DP1l glomeruli. De feilfelt viser området mellom første og tredje kvartiler av distribusjonen.

<ol>
	<li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+olfactory+systems+in+insects:+anatomy+and+function.">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li><li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila.">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li><li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+olfactory+processing.">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li><li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+information+processing+in+Drosophila.">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li><li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe:+new+developments.">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li><li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain.">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li><li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes.">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li><li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain.">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li><li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+Ca2++dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones.">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li><li>Galizia, C. G., Vetter, R. S., Christensen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). 13, 349-392 (2005).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca&#40;2+&#41;+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca&#40;2+&#41; probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li><li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release.">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li><li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception.">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+system+:+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes.">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system.">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+System:+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression,+Lineage+Tracing,+and+Mosaic+Analysis.">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li><li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons.">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Tilberedning og analysemetoder som er beskrevet her kan brukes til å analysere lukt-evoked responser i enhver populasjon av nevroner i antennal lapp (OSNs, LN og PNS) hvor en tilsvarende driver transgenet er tilgjengelig. Mens vi beskrive sin applikasjon som bruker en fluorescens mikroskop, kan optisk avbildning av dette preparatet like utføres ved hjelp confocal eller to-foton mikroskopi 22,32. Faktisk disse sistnevnte instrumentene lindre lys-spredning problemet med brede felt mikroskopi, som kan redusere oppløsningen på bilder, spesielt når store mengder nerveceller uttrykkelig reporteren. Dette preparatet vanligvis tillater opptak av lukt-evoked responser i minst en halv time, men denne gangen kan være betydelig lengre eller kortere avhengig av antall og lengde på målinger tatt opp, eksponeringstid brukes for hver ramme, og den inter-stimulus intervall. Videre kan to-foton eksitasjon redusere photobleaching av fluorescerende reporter, samt cellulære fototoksisitet, å tillate måling over lengre tidsperioder 22,32. Uansett valg av mikroskopet, er bevegelse av flua hjernen i hodet kapselen mest tilbakevendende problem når bildebehandling i intakte dyr. Mens bevegelse korreksjon kan korrigere mindre problemer (trinn 5,1), er det vanligvis bedre bare å ta opp fra svært stabile preparater. Strategier for å redusere bevegelse artefakter omfatter: (i) riktig å begrense snabel av fly med cactus ryggraden, (ii) immobilizing flua ben ved å feste dem på scenen med eicosane (før trinn 2,6) (eicosane kan smeltes på ~ 37 ° C, bruk en sølv ledning til å utvide og avgrense spissen av loddebolten for dette formålet), (iii) nicking spiserøret (synlig mellom antennal nervene) med fine pinsett. I tillegg til G-CaMP1.6 brukt her, en rekke optimaliserte versjoner av G-camp og andre kalsium indikatorer er tilgjengelige,som varierer i sine signal-til-støy-forhold, baseline fluorescens og timelige dynamikk 12,28,33. Den nøyaktige valg av sensor skal ta hensyn til alle disse egenskapene, og hvilken type av nevroner analyseres og den biologiske spørsmål blir adressert. Gjeldende sensorer rapporterer kalsium endringer som korrelerer relativt godt med action 12,34 potensialer, og deres videre forbedring, kombinert med økende antall spesifikke genetiske driver linjene 35 vil fortsette å øke potensialet for optisk avbildning av nevral aktivitet i intakt flua.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Leverandør </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Cactus ryggrad </td><td> Hagesenter </td><td></td><td> ~ 7mm lang tynn, ikke for fleksibel </td></tr><tr><td> Rosin </td><td> Strengeinstrument butikk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> To komponent silisium </td><td> WPI </td><td> Kwik-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Skreddersydde plexiglass montering blokk </td><td> Blueprints tilgjengelige fra <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kobber nett </td><td> Athene Rutenett </td><td> G220-5 </td><td> Normalt brukes for elektron mikroskopi prøver. </td></tr><tr><td> Skruer </td><td> Jernvarehandel </td&gt; <td></td><td> 2 mm diameter </td></tr><tr><td> Plast Dekkglass </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Loddebolten tips </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Regulert strømforsyning </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Tynn tråd </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0.013 mm </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Oppkjøp programvare </td></tr><tr><td> Monokromator </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Skrøpelig kniver </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Holder for blad </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire blad </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Dobbel kantet blad 1mm </td></tr><tr><td> Membran bensinpumper </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire knivfeste </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Tre veisventil </td><td> Lee Firma </td><td> LFAA1200118H </td><td> Konfigurasjon E </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Bivoks </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulose pad </td><td> Kettenbach Medisinsk </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinsett </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologi # 5 </td></tr><tr><td> Sprøyter </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Needles </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

Den antennal lapp er den primære olfactory senteret i insektet hjernen og representerer den anatomiske og funksjonelle ekvivalent av virveldyr luktelappen 1-5. Olfactory informasjon i den ytre verden overføres til antennal lapp ved olfactory sensoriske nevroner (OSNs), som segregerer til forskjellige regioner av neuropil kalt glomeruli i henhold til den spesifikke olfactory reseptoren de uttrykker. Her kan OSN axoner synapse med både lokale interneurons (LNS), hvis prosessene innervate mange forskjellige glomeruli, og projeksjon nevroner (PNS), som formidler olfactory informasjon til høyere olfactory områder av hjernen. Optisk avbildning av aktiviteten OSNs og LNS og PNS i antennal lapp - tradisjonelt bruker syntetiske kalsium indikatorer (f.eks kalsium grønn, Fura-2) eller spenning-sensitive fargestoffer (f.eks RH414) - har lenge vært en viktig teknikk for å forstå hvordan olfactory stimuli er representert som romlige og tidsmessige mønstreav glomerulær aktivitet i mange arter av insekter 6-10. Utvikling av genetisk kodede nevral aktivitet reportere, som for eksempel fluorescerende kalsium indikatorene G-camp 11,12 og 13 Cameleon, den Bioluminescent kalsium indikatoren 14,15 GFP-aequorin, eller en reporter av synaptisk overføring, har synapto-pHluorin 16 gjorde luktsystemet hos bananflue, Drosophila melanogaster, særlig tilgjengelig for nevrofysiologiske bildebehandling, supplerer sine omfattende-beskrevet molekylære, elektrofysiologisk og nevroanatomi egenskaper 2,4,17. Disse journalistene kan være selektivt uttrykkes via binære transcriptional styringssystemer (f.eks 18 GAL4/UAS, LexA / LexAop 19,20, Q system 21) i definerte populasjoner av nerveceller innenfor olfactory kretsene å dissekere med høy romlig og tidsmessig oppløsning hvordan lukt-genererte nevrale aktiviteten er representert, modulert og forvandlet 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Her beskriver vi de forberedelser og analysemetoder for å måle lukt-evoked responser i Drosophila antennal lapp med G-camp 25-27. Dyret forberedelse er minimal invasiv og kan tilpasses til bildebehandling ved hjelp av bred-feltet fluorescens, confocal og to-foton mikroskop.

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe at JoVE.com

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Vi beskriver en etablert teknikk for å måle og analysere lukt-evoked kalsium responser i antennal lobe av levende<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Kalsium Imaging av lukt-evoked Responses i Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Imaging Lukt-evoked Aktiviteter i Mus luktelappen bruker optisk Refleksjon og Autofluorescence Signaler

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronal Responses i Slice Produkter av vomeronasal Organ uttrykker en Genetisk Encoded Kalsium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Identifisering av Olfactory Flyktige ved hjelp av gasskromatografi-Multi-unit Recordings (GCMR) i Insekt antennal Lobe

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalsium Imaging for å visualisere hjernen Svar å endokrine signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Optical kalsium Imaging av Learning-indusert Synaptic plastisitet i Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Kultur av hjernekapillære pericytter for cytosoliske kalsiummålinger og kalsiumavbildningsstudier

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo kalsiumavbildning av mus Geniculate Ganglion Neuron Responser på smak stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalsiumavbildning i musen dårligere oliven

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Kalsiumavbildning i mus Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...