Name: calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe at JoVE.com

Vi bekräfta Silke Sachse och Beate Eisermann i utvecklingen av denna metod, Pablo Traversa för dragning monteringsblocket ritningar och Daniela Pelz för användning av den schematiska i figur 1. Vi är tacksamma mot Silke Sachse, Pavan Ramdya och Raphael Rytz för kommentarer på manuskriptet. R. Bell stöds av en Boehringer Ingelheim Foundation FD Fellowship. Forskning i R. Benton laboratorium är finansierat av ett europeiskt forskningsråd Starting Independent Researcher Grant och den schweiziska National Science Foundation.

1. Fästblocket Montering <ol><li> Den plexiglas monteringsblock (Figur 1A) bör göras för att de exakta specifikationerna som anges i plan (tillgänglig från <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) För att möjliggöra enkel montering och dissektion av flugan. Tråd genom skruvarna från baksidan, men inte utvidga dem utanför den främre delen av blocket, deras ställning kommer att justeras under beredningen av djuret (se 2,7). </li><li> Användning av en precisions borr, gör en buckla i den övre gränsen av den cirkulära kammaren för direkt, gräva under ytan för att göra plats för flugan kropp, vilket minskar tjockleken hos blocket vid denna punkt. </li><li> Skära en koppar galler med en skalpell vinkelrätt och i närheten av botten av slitsen för att skapa en &quot;krage&quot;. Kontrollera att de två resulterande flikarna är nivå, eftersom detta kommer att bidra till införandet av flugan. </li><li> Med en tandpetare, placera en liten droppe superlim på monteringsblocket över cirkulära kammaren för flugan. Placera koppar gallret på limmet och läge så att slitsen är centrerad på blocket (fig. 1 A). Tryck ner försiktigt och ta bort överflödigt lim. Med en pincett, tillsätt små droppar lim på de flikama på varje sida och vika rutnät över den främre delen av blocket så att slitsen pekar rakt nedåt. Se till toppen av gallret är i nivå med blocket. Låt torka helt. </li><li> Montera en tråd innehavaren skära plast täckglas på mitten och ta bort en central del för att göra en &quot;U&quot;-form. Använd bivax att limma en bit av tråd över toppen av &quot;U&quot;, gör inte tråden alltför spänt. </li><li> Konstruera antenn skärmen: gör ett hål i en plast täckglas med ett papper hole-punch. Trimma kanterna på täckglaset till 0,5 x 0,7 cm. Limma genomborrade plasten täckglaset till tejp och sedan placera en droppe etanol på bandet exponerad genom hålet för attavlägsna bindemedlet. </li></ol> 2. Djur Framställning <ol><li> Flugor av lämplig genotyp - dvs bär den önskade kombinationen av &quot;förare&quot; och verksamhetsbaserade reporter transgener - bör vara 1-3 veckor gamla, den kutikula yngre flugor är för mjuk och svår att skära. När experiment kräver direkt jämförelse mellan olika genotyper, och för att matcha transgenexpression nivåer bör flugor vara åldersmatchade för att undvika åldersrelaterade fysiologiska skillnader. Om kön är inte viktigt, föredrar vi att använda sig av kvinnliga flugor eftersom de har större huvuden och är lättare att manipulera. </li><li> Bedöva flugor genom att kyla på is. </li><li> Införa ett enda fluga i monteringsblocket. Håll farten med vingen gemensamma och skjut den, dorsal-ytan först, längs skåran av koppar nätet så att den är upphängd i halsen (figur 1B-C). Om det behövs, rotera den tills den ser ner. </li><li> Placera en fin kaktus rygg framför fly huvud för att förhindra den från att fly (Figur 1B-C). Placera kaktus ryggraden framför snabel för att förhindra den från att röra sig. Fäst kaktus ryggraden till blocket med bivax. Att säkerställa att den övre delen av huvudet är i nivå med den övre delen av blocket. </li><li> Fäst huvudet på flugan till blocket med en liten droppe av kolofonium (löst i etanol). Placera blocket i en fuktad box och låta kolofonium härda under cirka en timme. </li><li> Använd pincett, dra antenn plattan framåt och släppa tråden på hållaren (vax-sidan utåt, se 1,5) i cuticular vecket mellan antennen och huvudet. Fäst hållaren på framsidan av blocket med bivax. </li><li> Med skruvarna inbyggda i blocket, försiktigt tråden innehavaren framåt för att skapa lite utrymme mellan antenn plattan och huvudet. </li><li> Placera antenn skärmen (se 1,6) under början av flugan huvud med hålet placerat centralt. Fäst med bivax till toppen av monteringsblocket. </li><li> Med hjälp av en blad-splitter, Cuta litet hål i tejpen på skölden exponerar kutikula av flugan huvud bakom antennen. Hålet bör inte överskrida ögonen för att förhindra att preparatet läcker. </li><li> Försegla hålet mellan tejpen och ytterhud med tvåkomponent silikon. Ta bort överflödigt kisel från toppen av flugans huvud. </li><li> Placera en droppe av Drosophila Ringers saltlösning (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 36 mM sackaros, 5 mM HEPES, pH 7,3) på huvudet. Se till att det inte finns några läckor: antennerna bör förbli helt torr. Med en safir blad, skär ett hål i nagelbanden. Först, lätt poäng längs cuticular vecket direkt bakom antennen, klipp sedan längs ögonen och över ocelli på baksidan. Slutligen, vik bit nagelband över gjorde kanten och skär underifrån för att undvika avskiljer antenn nerverna. </li><li> Ta försiktigt bort körtlar och luftstrupen med fina pincett. Skölj upprepade gånger med Drosophila </em&gt; Ringers och lämnar en stor droppe på huvudet. </li></ol> 3. Lukt Stimulus Delivery <ol><li> Lukt sprutor: Sätt in en cellulosa dyna i en 2 ml plastspruta med rena pincett och pipett på den (med filter tips) 20 pl av lukt, utspädd som önskas i ett lämpligt lösningsmedel, med hjälp av pipettspetsen att trycka dynan djupt in i cylindern . Pluggen och hatten sprutan tills den behövdes. Färska lukt spädningar bör vara beredda åtminstone var 3 månader (eller oftare för mycket flyktiga och / eller ofta använda lukt), och nya dynor bör vara redo för lukt sprutor strax före varje inspelning. Använd inte lukt kuddar under mer än tre stimuli, eftersom lukten koncentrationen skulle förfalla. </li><li> Skräddarsydd olfaktometem (figur 2): en primär luftström (1 liter / min) är riktad genom teflonrör (0,4 mm inre diameter), 27 cm uppströms från utloppet av detta rör, en sekundär luftström (1 liter / min ) tillsätts. Båda luftströmmar genereras av membranpumpar, ochflödeshastigheten regleras genom två oberoende flödesmätare. Luften strömmar kan fuktas genom att passera genom vatten i gas tvätt flaskor, även om man bör vidtas för att undvika över-befuktning (dvs. mer än ~ 60%). Den sekundära luftströmmen riktas antingen genom en lukt spruta eller en tomma sprutan: sprutor anslutna till luftflödet genom en sprutnål (1,2 mm ytterdiameter) genomstickning av kolven. En tre-vägs magnetventil styrs via en ventil styrenhet (t.ex. Harvard Apparatus VC6) används för att växla mellan den rena luften och lukt stimulans. </li></ol> 4. Avbildning in vivo <ol><li> Vi beskriver här avbildning med en upprätt fluorescerande mikroskop (t.ex. stående fasta steg Zeiss Axio Examiner D1) utrustad med en 20x vatten mål (t.ex. Zeiss W &quot;Plan-Apochromat&quot; 20x / 1,0 M27 DIC) (Figur 2). För avbildning med G-CAMP (excitation / emission: 488/509 nm), använd ett filter block med följande egenskaper: 450-490 nm excitationsfilter, Dikroiska spegeln (T495LP) och 500-550 nm emission filter (Chroma ET). Placera monteringsblocket innehållande den fly under mikroskop. Positionera utloppet olfaktometem ca 0,5 cm framför flugan antenner. </li><li> Sänk målet tills den vidrör Ringers lösning på fluga huvud. Tittar igenom betraktaren under starkt fält belysning, placera preparatet så att hålet i huvudet kapseln är centrerad och dess gränser är i fokus. Växla till fluorescerande ljus och justera fokus tills du kan se de märkta nervceller (framgår av basal grön fluorescens av G-cAMP). </li><li> Fine fokus på glomeruli av intresse genom att förvärva bilder med en Charge-coupled device (CCD) kamera (t.ex. CoolSNAP-HQ2 Digital Camera System) är monterad på mikroskopet med lämplig förvärvet programvara (t.ex. Metafluor) (Figur 3A). Stänga membranet i belysning ljusvägen för att begränsa excitationsljus till det avbildade området. </li><li> För inspelning lukt-framkallataktivitet, ange förvärvet skattesats på 4 Hz och justera exponeringen tid att få fluorescens värden inom det dynamiska räckvidden för din CCD-kamera, men inte lägre än 1000 (godtyckliga enheter), med minst 12-bitars dynamisk upplösning. Exponeringstiden bör inte överstiga 100 ms, om möjligt, för att reducera G-cAMP fotoblekning. Om den rumsliga upplösningen i din kamera tillåter kan du öka binning (antal brunnar på chip som kommer att binned in i en digital pixel) för att minska exponeringstiden. Vi får bilder av 350x225 pixlar (med en binning av 2x2), vilket motsvarar 210x135 m vid beredningen. Dessa inställningar är optimala för att fånga glomerulära lukt-inducerade svar från G-Camp med god spatial och temporal upplösning och samtidigt begränsa reporter blekning. </li><li> Ställ in mätparametrar. Vi registrerar typiskt för 10 sekunder (dvs. 40 bilder), med lukt stimulering typiskt fall inleds 4 sekunder efter början av förvärvet perioden (ram 15) och varar en sekund (until ram 19). En fluga beredning kan normalt testas med upp till 25-30 olika lukt stimuli, ofta begränsas av en irreversibel nedgång i fluorescerande signalen från reportern på grund av fotoblekning. Mellan stimulus intervall beror på styrkan av observerad respons och hastigheten för fotoblekning. Lämplig längd mellan stimulus intervall för att undvika att sensoriska anpassningen kan bestämmas approximativt genom upprepad presentation av en positiv kontroll lukt (om känt) i rättegång experiment. Införande av denna lukt var ~ 10 stimuli i en viss serie kan tillåta kontroll av fortsatta lönsamhet och konsekvent gensvar av preparatet. </li></ol> 5. Databehandling och analys Data bearbetas med ImageJ (med Mac biofotonik plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) och anpassade skrivna program i Matlab och R enligt följande: <ol><li> Korrigera för artefakter prov rörelse:anpassa alla bilder som motsvarar ett djur preparat (t.ex. 30 mätningar av 40 frames i varje) med hjälp av &quot;stela kroppen&quot; läge för StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg</a> ) i ImageJ. Detta steg krävs för att avlägsna skift i positionen för de märkta neuroner med avseende på förvärvet ram inom och mellan mätningarna. Det är emellertid endast möjligt att avlägsna förskjutningar i xy-planet. Data bör kasseras om starka förändringar i fokus sker. </li><li> Segment stapeln i enskilda 10-sekund (40-ram) mätningar. </li><li> Korrekt för blekning artefakter: exponering för fluorescerande ljus kommer att orsaka fluorescens att sönderfalla under en enda mätning 10. I vissa fall är det viktigt att korrigera för denna upplösning innan data analyseras. För varje mätning beräknas en bakgrund ram. Detta bör vara medelvärdet av flera ramar innan stimulus debut (t.ex. ramar 6-14). Uppdela varje ram av detta backgrunt ramen för att erhålla de relativa fluorescensförändringar. Beräkna den genomsnittliga relativa fluorescensen värde för varje ram genom att ta medelvärdet alla bildpunkter inom området betecknat med G-cAMP. Montera en dubbel exponentiell till medelfluorescensen kurvan, med större beaktande av de ramar innan stimulans och noll vikt vid tiden för lukten svaret (20 ramar efter stimulans debut i vårt fall). Subtrahera den inpassade kurvan från den relativa fluorescens-kurvan för varje pixel. Multiplicera de korrigerade ramar som bakgrunden ramen till nytt få rådata. Denna typ av korrigering kan leda till en ändring i svaret dynamik, om signalen inte tillbaka till baslinjen i slutet av mätningen (t.ex. om hämmande eller mycket starkt stimulerande svar framkallas) (Figur 4). Även korrigering av blekning artefakter är användbart i många fall bör tolkningen av tidsmässiga parametrar göras med försiktighet om en blek rättelsen. </li><li> Beräkna den relativa förändringen i fluorescens (&amp; DeLTA, F / F) för varje bildruta av varje mätning som (F i-F 0) / F 0 * 100, där F 0 är bakgrunden ram (se 5,3), och F jag fluorescensen värdet för i: te ramen för mätningen. </li><li> Beräkna medelvärdet AF / F i en cirkulär region av intresse i en glomerulus (figur 3B) med en diameter av 10 pixlar för att erhålla aktivitetsspår (figur 5A). Om så önskas, omvandla dessa spår till heatmaps med ImageJ (Figur 5A). </li><li> Beräkna toppamplituden hos svaret genom att subtrahera medelvärdet AF / F av fyra ramar före stimulering från medelvärdet AF / F av fyra ramar under toppen hos svaret. Samma förfarande används både för att illustrera rumsliga svarsmönster (se figur 3B) och kvantifiera svaret amplituden i vissa regioner av intresse i flugor (se figur 5B). Den maximala känsligheten kan även kvantifieras genom integrering av arean under kurvan under tiden för stimulus eller averaging, vars ramar maximal hos svaret. </li></ol> 6. Representativa resultat Vi använde de protokoll ovan för att registrera och analysera propionsyra-evoked av flugor som uttrycker G-CaMP1.6 28 under kontroll av promotorn för lukt co-receptor IR8a, som är verksamt i flera olika populationer av OSN 29,30 ( Figurerna 3-5). Stimulering med 1% propionsyra framkallar ökningar av G-cAMP fluorescens - indikerar ökningar i intracellulärt kalcium - i OSN innerverar två glomeruli DC4 och DP1l (figur 3B). Vi illustrerar olika sätt att representera data från flera flugor i figur 5: linje aktivitet spår, heatmaps och en stång plot av toppsvaren. Propionsyra-evoked har skilda toppamplituder och tidsmässiga dynamik i DC4 och DP1l. Även svaren är i allmänhet robusta, kan variation mellan enskilda djur också observeras i både glomeruli (se hanatmaps i figur 5a). Kvantifiering av topp svaren (figur 5B) möjliggör en enkel statistisk jämförelse mellan olika glomeruli och olika luktämnen över djur. Däremot kan lukt-framkallade kalcium svar har icke-enhetliga tidsmässiga dynamik, och kvantifiera deras storlek med ett enda värde kommer bortse från denna komplexitet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> Figur 1. Schematisk av monteringsblocket (A) före och (B) efter införande av flugor, och (C) en övre vy i närbild (anpassad från 31). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> Figur 2. Schematisk ritning av experimentell uppställning. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> Figur 3. (A) uppifrån av flugan preparatet efter steg 2,8 (vänstra panelen) och rå fluorescens bild av anteNNAL lober märkt med G-CaMP1.6 (Genotyp: IR8a promotor: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 och DP1l glomeruli kan särskiljas genom deras morfologi, storlek och position och är märkta i rött och blått, respektive. (B) Färgkodad bild av svaret på propionsyra (1% volym / volym). Bilden motsvarar den AF / F av toppen för den respons som beräknas såsom förklaras i steg 5,6 (se även figur 5A). Den colorscale till vänster visar% AF / F värde. De svarta cirklarna indikerar positionen och storleken av området av intresse användas för att kvantifiera de svar (se figur 5). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> Figur 4. Korrigering blekning av fluorescerande reporter-signalen. Exempel på effekten av blekmedlet korrigering såsom beskrivs i steg 5,3. Exempeldata på den vänstra panelen kan korrigeras utan större förändringar i form av svaret. Exempeldata till höger panelen påverkar allvarligtED med blekmedel korrigering, troligen eftersom signalen sjunker och hålls under baslinjen efter lukt stimulans uppsägning. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> Figur 5 (A) Top. Tidsmässiga dynamik kalcium svaren från glomeruli DC4 (vänster) och DP1l (höger) till propionsyra (1% v / v). De svarta spåren visar medianen av medelvärdet AF / F inom regionen av intresse (se figur 3B) över åtta djur. Den grå yta indikerar intervallet mellan de första och tredje kvartiler av fördelningen. Presentation av median-och kvartilen värden ger mer information om variabilitet och distribution av observerade svar än medelvärde och standardfel. De gröna och magenta rutorna anger de ramar genomsnitt för att beräkna de maximala svaren som visas i Figur 3B, och kvantifieras i Figur 5B. Botten: de heatmaps visar svarsdata för alla enskilda djur i separata rader, med Af / F värden represented av colorscale (längst till höger). De horisontella svarta staplar indikerar den tidpunkt och varaktighet för stimulus. (B) Median topp svar propionsyra i åtta djur för DC4 och DP1l glomeruli. Felstaplarna visar intervallet mellan första och tredje kvartiler av fördelningen.

<ol>
	<li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+olfactory+systems+in+insects:+anatomy+and+function.">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li><li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila.">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li><li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+olfactory+processing.">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li><li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+information+processing+in+Drosophila.">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li><li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe:+new+developments.">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li><li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain.">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li><li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes.">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li><li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain.">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li><li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+Ca2++dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones.">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li><li>Galizia, C. G., Vetter, R. S., Christensen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). 13, 349-392 (2005).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca&#40;2+&#41;+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca&#40;2+&#41; probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li><li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release.">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li><li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception.">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+system+:+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes.">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system.">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+System:+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression,+Lineage+Tracing,+and+Mosaic+Analysis.">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li><li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons.">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Den beredning och analys av metoder som beskrivs här kan användas för att analysera lukt-evoked potential i någon population av nervceller i antenn loben (OSN, LN och PN) för vilka en motsvarande drivrutin transgen är tillgänglig. Medan vi beskriva dess program med ett fluorescensmikroskop kan optisk avbildning av denna beredning också utföras med konfokala eller två foton mikroskopi 22,32. Faktum är att dessa senare instrument lindra ljusspridande problemet med brett fält mikroskopi, vilket kan minska upplösningen av bilder, särskilt när ett stort antal nervceller uttrycker reporter. Detta preparat oftast möjliggör inspelningar av lukt framkallade svar för minst en halv timme, men den här gången kan vara betydligt längre eller kortare beroende på antalet och längden på inspelade mätningar exponeringstiden för varje ram och inter-stimulus intervall. Vidare kan två-foton-excitation reducera fotoblekning av fluorescerande rep-Örter samt cellulär fototoxicitet, för att medge mätning över längre tidsperioder 22,32. Oavsett valet av mikroskop, är rörelse av flugor hjärnan inuti huvudet kapseln mest återkommande problem vid avbildning i intakta djur. Medan rörelsen korrigering kan korrigera mindre problem (steg 5,1), är det oftast bättre bara för att spela in från mycket stabila beredningar. Strategier för att minska rörelse artefakter inkluderar: (i) ett korrekt sätt att begränsa de snabel i farten med kaktus ryggraden, (ii) immobilisera The Fly ben genom att fastställa dem till scenen med eikosan (före steg 2,6) (eikosan kan smältas vid ~ 37 ° C, använd en silvertråd att utvidga och förfina spets lödkolven för detta ändamål), (iii) hackning matstrupen (synliga mellan antenn nerverna) med fina pincett. Förutom G-CaMP1.6 används här, en rad av optimerade versioner av G-cAMP och andra indikatorer kalcium är tillgängliga,som skiljer sig i deras signal-brus-förhållande, baseline fluorescens och temporala dynamiken 12,28,33. Den exakta Valet av givare måste ta hänsyn till alla dessa egenskaper, vilken typ av nervceller analyseras och den biologiska frågan som behandlas. Strömsensorer rapporterar kalcium förändringar som korrelerar ganska bra med aktionspotentialer 12,34 och deras ytterligare förbättringar, tillsammans med ökande antal specifika genetiska föraren linjer 35 kommer att fortsätta att öka potentialen för optiska avbildning av neural aktivitet i det intakta flugan.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Leverantör </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kaktusen ryggraden </td><td> Handelsträdgård </td><td></td><td> ~ 7mm långa tunna, inte alltför flexibelt </td></tr><tr><td> Kolofonium </td><td> Stråkinstrument butiken </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tvåkomponent silikon </td><td> WPI </td><td> Kwik-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Skräddarsydda plexiglas monteringsblock </td><td> Ritningar tillgängliga från <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Koppar galler </td><td> Athene Grids </td><td> G220-5 </td><td> Normalt används för elektronmikroskopi prover. </td></tr><tr><td> Skruvar </td><td> Järnaffär </TD&gt; <td></td><td> 2 mm i diameter </td></tr><tr><td> Plast täckglas </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Lödkolv tips </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830.283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Reglerad strömförsörjning </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511.407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Tunn tråd </td><td> Isabellenhütte </td><td> ISA-ohm </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eikosan </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Acquisition Software </td></tr><tr><td> Monokromator </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Brytbara blad </td><td> Fina Science Tools </td><td> 10.050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Hållare för blad </td><td> WPI </td><td> 14.134 </td><td></td></tr><tr><td> Safir bladet </td><td> WPI </td><td> 500.314 </td><td> Tveeggad klinga 1mm </td></tr><tr><td> Membrane bensinpumpar </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire bladhållare </td><td> WPI </td><td> 500.317 </td><td></td></tr><tr><td> Trevägsventil </td><td> LEE COMPANY </td><td> LFAA1200118H </td><td> Konfiguration E </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Bivax </td><td> Siladent Technik </td><td> 209.212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulosa dyna </td><td> Kettenbach Medicinsk </td><td> 31.003 </td><td></td></tr><tr><td> Pincett </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologi # 5 </td></tr><tr><td> Sprutor </td><td> BD </td><td> 300.928 </td><td> 2 ml, Discardit II 2pieces </td></tr><tr><td> Needles </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

Den antenn loben är den primära lukt centrum i insekten hjärnan och representerar den anatomiska och funktionella motsvarigheten till ryggradsdjur luktloben 1-5. Lukt information i den yttre världen överförs till antenn loben med lukt sensoriska neuroner (OSN), som segregerar till olika regioner i neuropil kallas glomeruli beroende på den specifika luktreceptorer de uttrycker. Här kan OSN axoner synaps med både lokala interneuronen (LNS), vars processer innerverar många olika glomeruli och neuroner projektionsdukar (PNS), som förmedlar lukt information till högre luktsinne hjärnregioner. Optisk avbildning av aktiviteten hos OSN och LNS och PNS i antenn loben - traditionellt använda syntetiska kalcium indikatorer (t.ex. kalcium grön, FURA-2) eller spänningskänsliga färgämnen (t.ex. RH414) - har länge varit en viktig teknik för att förstå hur luktsinnet stimuli representeras som rumsliga och tidsmässiga mönsterav glomerulär aktivitet i många arter av insekter 6-10. Utvecklingen av genetiskt kodade neurala aktiviteten reportrar, såsom de fluorescerande kalciumindikatorer G-Camp 11,12 och Cameleon 13, det bioluminescenta kalcium indikator GFP-aequorin 14,15, eller en reporter av synaptisk överföring, har synapto-pHluorin 16 gjort Luktsinnet av fruktflugan, Drosophila melanogaster, särskilt tillgängliga för neurofysiologisk avbildning, komplettera sina omfattande beskrivna molekylära, elektrofysiologiska och neuroanatomisk egenskaper 2,4,17. Dessa reportrar kan selektivt uttryckas via binära transkriptions styrsystem (t.ex. GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q-system 21) i definierade populationer av nervceller inom luktsinnet kretsar att dissekera med hög rumslig och temporal upplösning hur lukt-framkallat neural aktivitet representerad, modulerade och omvandlas 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Här beskriver vi förberedelserna och analysen metoder för att mäta lukt-evoked potential i Drosophila antenn lob med G-Camp 25-27. Djuret beredningen är minimalt invasiv och kan anpassas till avbildning med bred-fälts-fluorescens, konfokal och två-foton-mikroskop.

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe at JoVE.com

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Vi beskriver en etablerad teknik för att mäta och analysera lukt-framkallade kalcium svar i antenn loben att leva<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Kalcium avbildning av Lukt framkallade svar i Drosophila Antenn lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Imaging Lukt-Evoked Aktiviteter i musen luktbulben med optisk reflektans och autofluorescens Signaler

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging Neuronal svar i Slice Beredningar av vomeronasala Orgel uttrycker en genetiskt kodade Kalcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Identifiering av Olfactory Flyktiga med gaskromatografi-Multi-enhet inspelningar (GCMR) i Insect antenn Lobe

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalcium Imaging för att visualisera hjärnan Svaren till endokrin signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo optisk kalcium avbildning av Inlärningsinducerad synaptisk plasticitet i Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Kultur av hjärnan kapillär pericyter för cytosoliska kalcium mätningar och kalcium Imaging Studier

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo kalciumavbildning av mus geniculate ganglion neuron svar på smak stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Kalciumavbildning hos mus Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...