Name: a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00
Duration: 7 min 48 s
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1. Transfecção da célula hospedeira <ol><li> Semente de 2 x 10 6 células CHO-DXB11 no frasco de cultura de células T75 Corning em 15 ml meio de crescimento (MEMA com nucleotídeos e nucleosídeos (Gibco, número de catálogo 12571) suplementado com 10% γ irradiados caracterizada soro fetal bovino (cFBS) (HyClone, número de catálogo SH30071.03) e 10 mL / L de solução de glicose 45% (Sigma, número de catálogo G8769)) um dia antes de transfecção. </li><li> No momento da transfecção, preparar complexos de transfecção da seguinte forma: <ol class="lalpha"><li> Diluir 8 DNA mg em 800 mL de meio de crescimento sem soro em um tubo de microcentrífuga estéril. Misture delicadamente. </li><li> Diluir 40 mL Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) em 800 mL de meio de crescimento sem soro em um tubo de poliestireno. </li><li> Adicione o DNA diluído para o ™ Lipofectamine diluída. Misture delicadamente e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Remova o meio de crescimento de células em T75 e substituir, com 6,4 ml de meio de crescimento sem soro. Adicione o ml 1,6 de complexos de transfecção ao balão. Misture delicadamente balançando a placa. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 por 6 horas. </li><li> Adicionar 8 ml de meio de crescimento para o balão e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante a noite. </li><li> Remova o meio de aspiração e adicione meio de crescimento frescas para o balão. Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante a noite. </li><li> Substituir o meio de crescimento com meio de seleção (MEMA meio sem nucleotídeos ou nucleosídeos (Gibco, número de catálogo 12561) suplementado com 10% γ irradiados soro fetal bovino dialisado (DFBS) (HyClone, número de catálogo SH30079.03) e 10 mL / L 45 solução de glucose% (Sigma, código G8769)). </li><li> Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 por 2-3 semanas. </li></ol> 2. Clonagem por separação de células Fluxo Citometria Activated <ol><li> Desalojar as células do frasco e centrifugar a 800 rpm por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em meio de seleção suplementado com 2% de albumina sérica bovina e fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano na diluição de 1:20. </li><li> Incubar no gelo por 15-30 minutos e depois lave duas vezes com PBS frio. Ressuspender as células em 1x PBS em um tubo de polipropileno. </li><li> Prepare-se para classificar asséptica em um FACSAria BD ™. Prepare de 96 poços da placa de cultura de células que contém 200 mL meio de seleção em cada poço. </li><li> Assepticamente carregar o tubo com as células e analisar em BD FACSAria ™, registrar os resultados para as células manchadas e sem manchas, respectivamente. </li><li> Definir as portas e as configurações para classificar uma única célula do perfil desejado de fluorescência de coloração em 96 poços da placa (s). <ol class="lalpha"><li> Células transfectadas são primeiramente analisados ​​com base na dispersão frontal versus dispersão lateral. Um portão de células vivas é feita com base na dispersão para a frente, que mede o tamanho de uma célula, e dispersão lateral, que mede a complexidade de uma célula ou granularidade. </li><li> As células que se enquadram nesta portão são então analisados ​​para a coloração de PE. PE portão negativo é definido para unstained células transfectadas ou células hospedeiras manchado. Como as células marcadas transfectadas são examinados pelo FACS, o &quot;High PE&quot; gate é então delineada para abranger o top 5% de todas as células que são positivos para a coloração de PE. </li></ol></li><li> Incubar as placas em 37 ° C incubadora por duas semanas. </li></ol> 3. Documentação de formação de colônia por CloneSelect ™ Imager Formação de documento colônia em placas de 96 poços na CloneSelect Imager ™ no dia 0, dia 3, dia 7 e dia 13 após FACS classificação. A documentação imagem vai garantir a selecção de clones derivados de uma única célula. Um passo fundamental nesta documentação está recebendo o plano focal ajustados corretamente para a medição dia 0, uma vez que existe apenas uma célula em cada poço a esse ponto. É muito importante que as imagens dessas células individuais estão em foco e tentar ajustar o foco sobre eles pode ser enganosa na melhor das hipóteses. O plano focal pode variar significativamente entre as marcas de placas e possivelmente até mesmo de lote para lote da mesma marca. Assim, um plano pré-determinado focal precisa ser usado. Isso pode ser feito concentrando-se em teste de micro-grânulos ou células de alta densidade depositados em placas do mesmo lote a ser utilizado. Alternativamente, as placas totalmente crescido a partir do mesmo lote pode ser utilizado para este fim. Depois FACS classificação, também é importante para permitir que as células se contentar com um mínimo de 2 horas antes da imagem, de modo que eles serão &quot;fixo&quot; na posição na chapa. 4. Triagem e seleção de clones altamente produtivos <ol><li> Posição documento de amostra no recebimento placas de 96 poços ensaio. </li><li> Alíquotas transferência de 20 mL sobrenadante (diluir, se necessário) em placas de 96 poços de ensaio pela Liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. Este robô flexível e capazplataforma IC foi adaptado para este trabalho e outra cultura automatizada de células. Programas especiais foram escritos para melhor utilizar e melhorar as capacidades Freedom EVO robótica para o desenvolvimento de linhagem celular. Um exemplo disso é a criação do TECAN para interpretar dados CloneSelect Imager ™ para amostragem de poços com colônias único. Outros programas foram necessários para executar tarefas adicionais de células da cultura, como fazer as diluições apropriadas das amostras colhidas, de interpretar, catálogo e placas de amostra manualmente marcados, se necessário, para aumentar os clones de alta produção, etc Muitos destes programas pode ser facilmente aplicado a 384 placas bem como bem como o formato de 96 poço original. </li><li> Produção de anticorpos nas amostras é analisada por um sanduíche de IgG humana detecção de ELISA (Pierce, Rockford, IL) sobre a liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. <ol><li> Amostras e standard (Human mieloma IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) foram carregados em pré-revestidas Bio Brasão anti-humano IgG Placas Assay (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> As placas foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas seguido de três lavagens PBS. </li><li> ImmunoPure Goat Anti-IgG humana (Fc-gama)-HRP (Pierce, Rockford, IL) foi adicionado à placa na diluição de 1:2000 e incubados por uma hora em temperatura ambiente. </li><li> As placas foram lavadas três vezes com PBS antes de adicionar ABTS substrato (Pierce, Rockford, IL) e foram lidas em um leitor de placas utilizando absorvância a 405 nm para a detecção. </li></ol></li><li> Selecionar clones altamente produtivos e avaliar a produtividade na cultura de suspensão. Para fed-batch cultura, as células foram inoculadas em 0.3X106 células / mL em meio livre de proteína ADVANTAGE JRH IMEDIATA 65.578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS), suplementado com 5 g / L de soja hidrolisado (DMV International, número de catálogo SE50MAF-UF muito, número) e incubados a 37 ° C com 7,5% de CO 2. A cultura continuou e foram suplementados com 2 g / L de glicose (Sigma, código G8769, número de lote 098K2329) quando glicose mais concentração de lactato na cultura chegou abaixo de 2 g / L, e 2 alimentados mM de glutamina (Gibco, número de catálogo 25030, número do lote 568177), quando os níveis de glutamina chegou abaixo de 200 mg / L (metabólitos medidos por YSI Bioanalyzer). Fed-batch culturas foram encerradas no dia 14 ea produção de anticorpos foi medida por HPLC fase reversa. </li><li> Caracterização genética de clones candidato por hibridização fluorescente in situ (FISH) 5. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um exemplo de desenvolvimento de anticorpos produzir clones com o método de alto rendimento é mostrado na Figura 1 e Figura 2. Pool de células transfectadas foi corado com fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano (Figura 1A), analisados ​​e classificados em BD FACSAria ™ (Figura 1B). Formação de colônias em placa de 96 poços foi fotografada em CloneSelect Imager ™ (Figura 1C). Sobrenadante de cultura de células foi amostrado de poços que contêm única colônia e analisados ​​por ELISA no EVO Liberdade TECAN ® sistema de manipulação de líquidos (Figura 1D). Clones altamente produtivos foram encontrados a partir de células que apresentaram maior nível de anticorpo de superfície refletida pela coloração fluorescente com anticorpo anti-IgG humana. Quando se comparam clones gerados a partir de duas populações do pool de células transfectadas inicial, uma grande diferença na produtividade em cultura em batelada alimentada foi observada (Figura 2). Para os dois primeiros clones gerados a partir da população de células com alta expressão de superfície de anticorpos (PE alta), a produtividade específica variou 50-70 pg / célula / dia. Considerando que a produtividade de anticorpos foi de ~ 20 pg / célula / dia para os dois clones gerados a partir da população de células com baixa expressão de superfície de anticorpos (PE baixo). Além disso, linhagens de células desenvolvidas pela classificação FACS são mais estáveis ​​em relação à produção de anticorpos do que aqueles que foram clonados por diluição calagem manual (Figura 3A). A produtividade específica do clone de topo, &quot;Clone 1&quot;, gerado por diluição manual de calagem caiu de ~ 30 para ~ 10 pcd pcd após o cultivo de 80 duplicações celulares. Por outro lado, a top subclone gerados por FACS classificação, &quot;Clone 2&quot;, foi capaz de manter a produtividade específica em torno de 20 pcd para pelo menos 100 duplicações celulares. Por hibridização fluorescente in situ (FISH), demonstramos Clone 1 mostrou como uma população mista de fenótipo A (85%) e fenótipo B (15%). Em contraste, FACS classificadas clone (clone 2) mostrou-se uma população mais homogênea, com 99,5% das células mostrou-se fenótipo A. (Figura 3B) <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Desenvolvimento de linhas de produção de células para a produção de anticorpos monoclonais a partir de células CHO. A) coloração da superfície da piscina célula inicial transfectadas com fluorescente etiquetado anticorpos IgG anti-humano. B) A classificação da população de células com alta intensidade de fluorescência (PE de alta) e baixa intensidade de fluorescência (PE baixo) em placa de 96 poços. C) Documentar colôniaformação desde o primeiro dia pós-semeadura de 0 a 13 dias em CloneSelect Imager ™. D) Screening clones por ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Superfície nível de anticorpos associados se correlaciona com a produtividade de anticorpos da célula. Clones com alta e baixa coloração fluorescente foram desenvolvidos em linhas celulares e avaliados em cultura em batelada alimentada. Volumétrica título e produtividade foram comparadas entre os top 2 clones de cada população. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Clones gerados a partir de FACS classificação exibem maior homogeneidade genética e estabilidade clone. A) a estabilidade da produção de anticorpos em cultura de lote para ~ 80 duplicações celulares de tempo decorrido cultura. Δ, clone foi gerada através da diluição limitante, onde as células foram semeadas em 2000 células / poço, 1000 células / poço e 500 células / poço. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triângulo preto" /> , Clone foi gerada através de FACS em 1 célula / poço. B) Transgene sítio de integração no cromossomo CHO célula é identificada por hibridização fluorescente in situ.

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

Os autores deste artigo são funcionários da Inc., Merck &amp; Co., que utilizam este método para a produção em larga escala de proteínas terapêuticas a partir de linhas de células de mamíferos.

Nós apresentamos um sistema automatizado de fabricação de células plataforma de desenvolvimento de linha que permite o isolamento de clones altamente produtivos, e na média, enquanto garante clonalidade e estabilidade clone. A contratação de coloração anticorpo de superfície seguido por separação de células FACSAria ™ é a chave para a obtenção de clones único com produtividade elevados de anticorpos. Nossos resultados e outros relatórios 2-4 sugerem que o nível de anticorpos transitoriamente exibido na superfície da célula bem correlacionados com a produtividade da célula. Assim, um anticorpo conjugado com fluoresceína pode ser usada para reconhecer o produto membrana associados e ajuda o isolamento de grandes produtores. Alternativamente, co-expressão de genes repórter e tecnologia microdrop gel têm sido usados ​​para facilitar a seleção de clones de alta produção por FACS 6-8. Além de isolar clones de alta produção via FACS, outras tecnologias têm evoluído para atingir o mesmo objetivo. Estes incluem Trellis tecnologia CellSpot Bioscience que usa sistemas de detecção de anticorpos microspere e tecnologia a laser de triagem para identificar clones altamente produtivos e eliminar células indesejáveis, Genetix ClonePix FL e StemCell Technologies ClonaCell plataforma EasyPick que realizar a triagem de alto rendimento de linhas de produção de células usando um sistema de detecção de anticorpo fluorescente . Optamos por implementar o método de clonagem FACS com base na superfície nível de anticorpos associados, porque combina a facilidade de operação, a seletividade na produtividade e clonalidade. O emprego de TECAN EVO ® Freedom sistema de manipulação de líquidos aumentaram significativamente throughput screening, que oferecem a oportunidade de selecionar clones de alto rendimento a partir de um pool de células muito maiores. Outros instrumentos para o ensaio, como HTRF, BioForte Octet, HPLC, etc, são todos os meios possíveis de selecionar os produtores de alta e triagem para produtores de baixa. Acompanhando a formação de clone com CloneSelect Imager ™, geramos documentação necessária para provar clonalidade com a história digitalizados linha celular. Clonalidade é ainda confirmada por caracterizar geneticamente único sítio de integração do transgene no cromossomo. Um passo subclonagem, que normalmente é tomado para assegurar clonalidade, pode assim ser eliminado. Isso vai poupar 4-8 semanas de tempo para o desenvolvimento de linhagem celular. Em resumo, as linhas de células de qualidade gerados pela plataforma de alto rendimento automatizada mostrou alta produtividade, estabilidade de produção e história documentada linha de células que devem atender à demanda de produção em larga escala e atuais exigências regulamentares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ Sorter celular </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® sistema de manuseio de líquidos </td><td> Tecan Grupo </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

A indústria biofarmacêutica rápido crescimento demandas rápido desenvolvimento de sistemas de produção altamente eficiente e confiável para atender a necessidade crescente de fornecimento de medicamentos. A geração de linhagens de células de produção tradicionalmente envolvidos operações manuais que são de trabalho intensivo e de baixo rendimento e vulnerável a erros humanos. Nós relatamos aqui uma plataforma integrada de alto rendimento e automatizados para o desenvolvimento de linhas de fabricação de células para a produção de proteínas terapêuticas. A combinação de BD FACS Aria ™ Sorter Cell, CloneSelect ™ Imager e TECAN Freedom EVO ® sistema de manipulação de líquidos, permitiu um alto rendimento e mais eficiente processo de desenvolvimento de células de linha. Nesta operação, células hospedeiras de produção são os primeiros transfectadas com um vetor de expressão com o gene de interesse 1, seguido pelo tratamento com um agente de seleção. As células estavelmente transfectadas são então marcadas com fluorescência rotulados de anticorpos IgG anti-humanos, e são posteriormente sujeitas a análise de citometria de fluxo 2-4. Células altamente produtivas são selecionados com base na intensidade de fluorescência e são isoladas por uma única célula de classificação em um FACSAria BD ™. Formação de colônias a partir de uma única célula estágio foi detectada ao microscópio e uma série de imagens em tempo-voltas digitais são tomadas por CloneSelect ™ Imager para a documentação da história da linhagem celular. Depois de clones único formaram, estes clones foram selecionados para a produtividade por ELISA realizado em Liberdade TECAN EVO ® sistema de manipulação de líquidos. Aproximadamente 2.000 - 10.000 clones podem ser rastreados por ciclo de operação com a configuração atual do sistema. Esta abordagem integrada tem sido utilizada para gerar alta produção ovário de hamster chinês linhas (CHO) de células para a produção de anticorpos monoclonais terapêuticos (mAb), bem como suas proteínas de fusão. Com a ajuda de diferentes tipos de sondas de detecção, o método pode ser usado para o desenvolvimento de terapias protéicas outros ou ser aplicada a sistemas outro host de produção. Comparando com o procedimento manual tradicional, esta plataforma automatizada demonstrado vantagens da capacidade significativamente aumentada, clonalidade assegurada, rastreabilidade na história linha celular com documentação eletrônica e oportunidade muito reduzida no erro do operador.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

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