Name: isolation of functional cardiac immune cells
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Functional Cardiac Immune Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en UNCF-Merck Graduate Science Research Disputation Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute beviljar RO1-HL-62.228 (JSJ) och RO1-HL-073.990 (JSJ).

1. Beredning av Hanks Balance Salt Solution (HBSS) <ol><li> Autoklav 1 L glasbägare, tog examen 1000 ml cylinder och rör bar. </li><li> Rekonstituera HBSS pulvret lösningen i autoklaveras 1 L glasbägare på 900 ml märket med dubbeldestillerat vatten. </li><li> Blanda HBSS lösning med 3,4 g Hepes Na + salt och justera pH till ett värde mellan 7,35-7,41 med antingen koncentrerad HCl eller NaOH. </li><li> När det önskade pH-värdet har uppnåtts och förblir stabilt, tillsätt 5 g bovint serumalbumin till lösni...

<ol>
	<li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity.">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li><li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats.">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li><li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function.">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li><li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats.">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li><li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat.">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li><li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure.">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+Cells:+Versatile+regulator+of+inflammation,+tissue+remodeling,+host+defense+and+homeostasis.">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li><li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure.">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li><li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-&#x0251;+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats.">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-&#x0251; Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li><li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-&#x0251;,+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia/Reperfusion.">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-&#x0251;, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li><li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-&#945;+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload.">TNF-&#945; inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li><li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells.">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li><li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart.">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li><li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart.">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li></ol>

Denna metod för att isolera hjärt immunceller möjliggör analys av deras funktion, fenotyp, och mognad utan oönskade aktivering som normalt sker under en traditionell enzymatisk spjälkning isolering teknik. Det genomsnittliga totala antalet celler erhålls med denna teknik är ca 400 tusen per råtta hjärta och differentierad färgning och flödescytometri analys av dessa celler visar blandad population av T-lymfocyter (~ 70%), makrofager (~ 12%) och mastceller med användningen av denna teknik. (~ 12%). 13, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på Reagens och utrustning </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt </td><td> Sigma </td><td> H4891 </td><td> En flaska gör ett L i Hanks Balance Salt Lösning. Bered Hanks Balance Salt Lösning som en del av förfarandet. </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> 250 ml Nalogene Filter Flaska </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> För 6 N, lägga lika volymer av HCL avjoniseratvatten. </td></tr><tr><td> 10 N NaOH </td><td> Fisher Scientific </td><td> SC267 </td><td> För 5 N, lägga till lika delar NaOH till avjoniserat vatten. </td></tr><tr><td> Dubbeldestillerat vatten </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabell av specifik utrustning: <table border="1"><tbody><tr><td> Namn på Reagens och utrustning </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 3-O Suture Silk Flätad </td><td> Ethicon Produkter </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> Small Animal Fläkt </td><td> CWE Incorporated </td><td> SAR-830 </td><td> Ställ andning till 40,5 andetag per minut. </td></tr><tr><td> Bevel 18 gauge </td><td> BD Biosciences </td><td> 305.199 </td><td> Trim nål med 1 / 2 till 3 / 4 av sin ursprungliga längd för användning som en trakealtub. </td></tr><tr><td> Teflon Tips (med nål bort) av 24-gauge Baxter snabb-Cath kateter </td><td> Baxter </td><td> 2N111 </td><td> Minska Teflon Tips längd av 1 / 2 till 3 / 4. </td></tr><tr><td> 10 cc spruta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-823-16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Falcon rör </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RT6000B kyld centrifug </td><td> Fisher Scientific </td><td> 75-004-377 </td><td> Kom ihåg att förkyla och förvara vid 4 ° C. </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Vetenskapliga </td><td> HS-LB-1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of functional cardiac immune cells

Hjärtat immunceller vinner intresse för de roller de spelar i den patologiska remodeling i många hjärtsjukdomar 1-5 Dessa immunceller, som omfattar mastceller, T-celler och makrofager,. Lagra och frigöra en mängd biologiskt aktiva mediatorer, inklusive cytokiner och proteaser som tryptas. 6-8 Dessa mediatorer har visat sig vara viktiga aktörer i extracellulära matrix ämnesomsättningen genom att aktivera metalloproteinaser eller orsakar kollagen ackumulering genom att modulera hjärt fibroblaster &quot;-funktionen. 9-11 dock tillgängliga tekniker för att isolera hjärt immunceller har varit problematiskt eftersom de använder bakteriella kollagenas att smälta myocardial vävnad. Denna teknik medför aktivering av immunceller och därmed en förlust av funktion. Till exempel hjärt mastceller blir betydligt mindre känsliga för ämnen som orsakar degranulering. 12 Därför har vi utvecklat en teknik som gör det möjligt för tHan isolering av funktionella hjärt immunceller som skulle leda till en bättre förståelse för vilken roll dessa celler i hjärtsjukdom. 13, 14 Metoden kräver en förtrogenhet med anatomiska belägenhet råttans xiphoid process, armhålan och falciform ligament och hjärtsäcken i hjärtat. Dessa landmärken är viktigt att öka framgången för förfarandet och att säkerställa en högre avkastning på hjärt immunceller. Dessa isolerade hjärt immunceller kan sedan användas för karakterisering av funktionalitet, fenotyp, mognad, och co-kultur experiment med andra hjärt-celler för att få en bättre förståelse för deras interaktioner.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Functional Cardiac Immune Cells at JoVE.com

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Denna metod för att isolera funktionella immunceller från hjärtat ger ett alternativ till konventionella metoder för kollagenas matsmältning, som orsakar oönskade immunceller aktiveras, vilket resulterar i en minskad lyhördhet av dessa celler. Vår metod för isolering ger funktionella hjärt immunceller genom att undvika problem i samband med enzymatisk spjälkning.

Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av immun fettvävnad celler

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolering, karakterisering och funktionella Undersökning av tandkötts Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering och karakterisering av neutrofiler-derived mikropartiklar för funktionella studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...