Name: isolation and characterization of rna-containing exosomes
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door de Zweedse Research Council (K2008-57x-20 676-01-3).

1. Exosome isolatie <ol><li> Groeien cellen in medium met exosome-vrij serum. Dus, elke serum toegevoegd aan het celkweekmedium moet worden ontdaan van exosomes door ultracentrifugatie op 120 000 xg gedurende de nacht bij 4 ° C vóór gebruik. </li><li> Breng de celsuspensie te conische buizen. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet de cellen. </li><li> Breng de supernatant te buizen ultracentrifuge, en zo niet helemaal vol toe te voegen PBS. </li><li> Centrifugeer het monster bij 16 500 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C om verder te verwijderen cellen en celresten. </li><li> Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,2 um filter om deeltjes die groter zijn dan 200 nm te verwijderen. </li><li> Overdracht van de gefiltreerde bovenstaande nieuwe ultracentrifuge buizen en verzegelen de buizen voor de ultracentrifuge bij 120 000 xg gedurende 70 minuten bij 4 ° C om de pellet exosomes. </li><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Voor maximale exosome ophalen, resuspendeer de exosome verrijkened pellet herhaaldelijk in een klein volume (~ 3 x 50 ul) van een geschikte buffer. Deze buffer is afhankelijk van de downstream-experimenten gepland na de exosome isolatie. Bijvoorbeeld, lysis buffer wordt gebruikt voor eiwit-en RNA-isolatie, wordt gebruikt voor PBS elektronenmicroscopie en flow cytometrie en voor functionele studies medium de voorkeur hebben. </li></ol> Let op; exosomes kan ook worden geïsoleerd uit verschillende lichaamsvloeistoffen, zoals plasma, volgens dezelfde procedure als voor celcultuur media. Voor viskeuze vloeistoffen kan het nodig zijn om het monster te verdunnen met PBS voorafgaand aan het centrifugeren en filtratie stap. In verband met de centrifugeersnelheid voor punt 5 hierboven, kan het worden verhoogd tot 29 500 xg, en de ultracentrifugatie in punt 7 kan worden uitgebreid tot 90 minuten 18. Als het monster verder moet worden gezuiverd van de exosome pellet kan drijven op een sucrose gradiënt en de exosomes zal voornamelijk te vinden in de fractie representing een dichtheid van 1,13-1,19 g / ml 2. 2. Exosome identificatie door elektronenmicroscopie <ol><li> Om verder te elimineren verontreinigende eiwitten, resuspendeer de exosome verrijkt pellet in PBS en ultracentrifuge bij 120 000 xg gedurende 70 minuten bij 4 ° C opnieuw pellet de exosomes. </li><li> Neem een ​​kleine hoeveelheid van het monster voor eiwit isolatie en totaal eiwit meting. Zorg ervoor dat slechts een klein deel van het monster wordt gelyseerd en gebruikt voor de eiwit-meting en houdt de intacte exosomes, opgelost in PBS, afzonderlijk op ijs of bij -80 ° C voor verdere experimenten. </li><li> Plaats een druppel, ongeveer 10 ug van exosomal eiwit van het intacte exosomes geresuspendeerd in PBS, op een Parafilm. Dan, met een pincet voorzichtig een positie formvar carbon gecoate nikkel rooster op de top van elke druppel gedurende 30-60 minuten. Verzekeren dat het rooster is geplaatst met de coating zijde naar de drop met exosomes. </li><li> Plaats drie druppels, die elk 30 ul van PBS op tHij Parafilm en was het net door achtereenvolgens de plaatsing van de raster op de top van de druppels van de PBS, en gebruik een absorberend papier tussen. Gebruik het absorberend papier voorzichtig gewoon door vast te houden nauw aan de kant van de grid, zonder contact te maken met de gecoate oppervlakte. </li><li> Bevestig het monster door storting een daling van 2% paraformaldehyde op de Parafilm en plaats het rooster op de top van de drop voor 10 minuten. </li><li> Herhaal de wasstap in punt 4, alvorens immunokleuring met een passende antilichaam. Veel gebruikte antilichamen zijn anti-CD63 en anti-MHC klasse II. Elektronenmicroscopie kan ook worden uitgevoerd zonder immunokleuring als exosomes kan worden geïdentificeerd uitsluitend op basis van grootte en morfologie. Toch raden wij u aan de grootte, morfologie en de aanwezigheid van een membraan eiwit voor een meer definitieve validatie te evalueren. </li><li> Overdracht van het raster om een ​​30 ul daling van het primaire antilichaam van keuze en incubeer gedurende 40 minuten. Was door het herhalen van punt 4, maar gebruik 0,1% bovine serum albumine in PBS in plaats van PBS alleen. </li><li> Herhaal punt 7, maar met de 10 nm-goud gelabeld secundair antilichaam en wassen met PBS alleen. </li><li> Post-fix het monster door het toevoegen van een daling van 2,5% glutaaraldehyde aan de Parafilm en incubeer het raster op de top van de drop voor 10 minuten. Herhaal de wassen in punt 4, maar gebruik vijf druppels gedemineraliseerd water in plaats van drie druppels PBS. </li><li> Contrast van het monster door het toevoegen van een daling van 2% uranylacetaat aan de Parafilm en incubeer het raster op de top van de daling gedurende 15 minuten. </li><li> Insluiten het monster door het toevoegen van een daling van 0,13% methylcellulose en 0,4% uranylacetaat aan de Parafilm en incubeer het raster op de top van de drop voor 10 minuten. </li><li> Verwijder het teveel aan vloeistof door zachtjes met een absorberend papier, voor het positioneren van de grid op een papier met de gecoate zijde naar boven en laat het drogen aan de lucht gedurende 5 minuten. </li><li> Onderzoek van de preparaten met een elektronenmicroscoop of bewaar de roosters in een rooster box voor de toekomstige werkzaamheden. </li></ol> 3.Exosome karakterisering door flowcytometrie Omdat exosomes zijn te klein om worden gedetecteerd door de huidige flowcytometrie apparatuur, is het nodig om eerst de exosomes binden aan antilichamen gecoate kralen (figuur 1). Deze kralen kunnen worden gekocht als een kant en klaar product of worden gedaan in het laboratorium met het antilichaam van keuze. Afhankelijk van de exosomal cellulaire oorsprong, kunnen verschillende antilichamen worden gekoppeld aan kralen dat kan worden van magnetische of latex karakter. We op dit moment gebruik van anti-MHC klasse II of anti-CD63 gecoate parels voor deze analyse. <ol><li> Voor het gebruik van &quot;zelfgemaakte&quot; antilichaam gecoate kralen maken we gebruik van 4 micrometer latex bolletjes gecoat met anti-CD63 antilichaam. Was 25 pi 4 micrometer latex bolletjes (30 x 10 6 beads) twee keer in 100 ul MES buffer, 3 000 xg gedurende 15-20 minuten en Neem het pellet in 100 ui MES buffer. Bereid het antilichaam mengsel met een volume gelijk van 12,5 ug antilichaam met hetzelfde volume van MES buffer. Voeg dekralen aan het antilichaam mengsel en incubeer onder roeren gedurende een nacht bij kamertemperatuur. Was het antilichaam gecoate kralen drie maal met PBS (3 000 xg gedurende 20 minuten) en los de pellet in 100 ui van opslag buffer (met een uiteindelijke concentratie van 300 000 kralen / ul). </li><li> Voor elk monster (elke antilichaam), gaat u verder met een volume gelijk is aan een minimum van 30 ug van exosomal eiwit (van de intacte exosomes opgelost in PBS) per ~ 100 000 antilichaam gecoate kralen. </li><li> Incubeer exosomes en kralen, in een totaal volume van 300 ul PBS, meer dan nacht bij 4 ° C onder zachte beweging. </li><li> Blokkeren door het toevoegen van 300 pi van 200 mM glycine en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Was de exosome-kraal complexen twee keer in wasbuffer (1-3% serum in PBS), 600 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Incubeer de exosome-kraal complexen met 50 ul IgG-antistoffen bij 4 ° C. Twee keer was de exosome-kraal complexen in wasbuffer zoals beschreven in stap 5. </li><li> Voeg 90 ul wasbuffer en 10 piantilichaam van keuze (idealiter anti-CD9, anti-CD63 of anti-CD81) om het exosome-kraal complexen en incubeer gedurende 40 minuten onder zachte beweging. Was de exosome-kraal complexen twee keer in wasbuffer zoals beschreven in stap 5. </li><li> Voeg 300 ul wasbuffer en het verwerven van gegevens met behulp van flowcytometrie. </li></ol> Zoals hierboven besproken, verschillende kralen kunnen worden gebruikt, zoals latex bolletjes, zoals beschreven in het protocol of magnetische korrels. Als magnetische korrels worden gebruikt in plaats, gelieve te noteren, dat het protocol is iets anders. De blokkering stap (punt 4) is niet vereist en de was wordt uitgevoerd door het plaatsen van de buis in een magnetische stand in plaats van een centrifugeren. De opslag buffer gebruikt voor de &quot;zelfgemaakte&quot; antilichaam gecoate kralen, bevat 0,1% glycine en 0,1% natrium azid in PBS, met een pH van 7,2. Belangrijker is, zorg ervoor dat de exosome uitgeputte serum te gebruiken voor de flowcytometrie wasbuffer (1-3% serum in PBS), om het risicoserum exosomes besmetten de analyse. Let op; bij het uitvoeren van exosome karakterisering door gebruik te maken antilichaam gekoppeld kralen is het belangrijk te erkennen dat het slechts een specifieke subpopulatie, specifiek voor de gebruikte antilichaam, dat is geïsoleerd en gekarakteriseerd. 4. Exosome detectie door Western blot Western blot is een gevestigde methode en we zullen niet in detail te gaan over de methode zelf, maar focus op het belang van een geschikte eiwitisolatie voor de Western blot en het gebruik van verschillende antilichamen. <ol><li> Los de exosome pellet in het eiwit lysis buffer van keuze en pipetteren grondig, gevolgd door een vortex-menging. Om verder lyse van de exosomes, ultrasone trillingen het monster in een waterbad 3 x 5 minuten met vortex-menging in tussen. Eindelijk centrifuge van het monster, 13 000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en breng het supernatant naar een nieuw eppendorfbuisje. </li><li> Meetre van de totale hoeveelheid eiwit met een methode voor de keuze en de belasting 20-50 ug eiwit per goed. </li><li> Scheiden en de overdracht van de eiwitten door gel elektroforese en electroblotting. </li><li> Blok en was het membraan voordat u immunokleuring tegen eiwitten verrijkt met exosomes. </li><li> Detecteren de specifieke eiwit door chemiluminescentie, digitale imaging-systeem en analyse software. </li></ol> Aangezien er geen exosome specifieke markers, eiwitten die zijn verrijkt met exosomes, van alle verschillende cellulaire oorsprong, worden vaak gebruikt voor exosome detectie. Dit zijn eiwitten zoals tetraspanins (bijv. CD9, CD63 en CD81), cytoskelet geassocieerd eiwit (bijv. Ezrin) en eiwitten die betrokken zijn bij multivesiculaire biogenese (bijv. Tsg101 en Alix). Andere eiwitten die ook vaak worden gedetecteerd in exosomes zijn Flotillin, Hsc70 en verschillende rab eiwitten etc. Maar er zijn ook cel-specifieke eiwitten in exosomes zoals de A33 (darmepitheelcellen), CD3(T cellen) en MHC klasse II (antigeen presenterende cellen). Zo kunnen variëren, afhankelijk van van wat celtype de exosomes vrijkomen uit de markers voor de detectie. Als andere compartimenten van de cel ook kan produceren blaasjes, is het verder aan te raden om de aanwezigheid van eiwitten uit deze compartimenten, zoals het endoplasmatisch reticulum (bijv. calnexin en Grp78) en het Golgi-apparaat (bijv. GM130) te bepalen. Zo, het ontbreken van deze eiwitten geeft aan geen of weinig besmetting van blaasjes van de andere compartimenten in het monster bestudeerd. 5. Isolatie van exosomal RNA en RNA-analyse <ol><li> Los de exosome pellet in de RNA-lysis buffer van keuze en RNA-extractie uit te voeren. Verschillende RNA isolatie kits kunnen worden gebruikt, afhankelijk op de downstream-experimenten, maar kolom gebaseerde methoden biedt monsters met een breder spectrum van RNA. We zijn momenteel met behulp van miRCURY RNA Isolation Kit van Exiqon, maar andere kits kan geschikt zijn, afhankelijk van de scientific vraag bij de hand. </li><li> Bij het uitvoeren van RNA-isolatie is het belangrijk om te werken in een RNase-vrije omgeving. Gebruik daarom nucleïnezuur en nuclease gratis pipetpunten en veeg zowel de bank en de uitrusting vrij van verontreinigingen en RNases. </li><li> Voor RNA-isolatie, door gebruik te maken miRCURY RNA Isolation Kit, ontbinding van de exosome pellet in 350 ui van lysis-oplossing en het uitvoeren van vortex-mixing gedurende 15 seconden. </li><li> Voeg 200 ul van 95% ethanol en vortex-mixing voor 10 seconden. </li><li> Plaats een kolom in een collectie buis en breng de gelyseerd exosomes op de kolom en centrifugeer 1 minuut bij 14 000 x g. </li><li> Was driemaal uit door de toevoeging van 400 ul van Wash Oplossing voor de kolom met de exosomal RNA en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14 000 x g. </li><li> Centrifugeer de kolom voor 2 minuten bij 14 000 xg om ervoor te zorgen dat de kolom droog is en plaats de droge kolom in een RNase-vrij eppendorfbuisje. </li><li> Voeg 50 ul elutiebuffer de kolom en centrifugeer gedurende 2<html> minuten bij 200 xg, gevolgd door 1 minuut bij 14 000 x g. </li><li> Ga verder met de geïsoleerde RNA of opslaan in -80 ° C. </li></ol> Voor de detectie en analyse van het geëxtraheerde totaal exosomal RNA, gebruik maken van een Agilent 2100 Bioanalyzer met de RNA 6000 Nano-of RNA-6000 Pico Kit. Uit de analyse blijkt de exosomal RNA opbrengst en grootteverdeling. 6. Representatieve resultaten Exosomes zijn te klein om worden gedetecteerd door de beschikbare flowcytometrie methoden, en zijn daarom aan antilichaam-gecoate kralen alvorens te worden geanalyseerd (figuur 1). Als exosome-kraal complexen kunnen voegen de flow cytometrie scatterplot kunnen bevatten verschillende populaties van enkele, dubbele en driedubbele kralen (figuur 2A). De pijl geeft de single kralen die verder worden geanalyseerd. Een CD63 positieve enkele bead-exosome bevolking ten opzichte van zijn isotype controle is weergegeven in figuur 2B. e_content &quot;&gt; Vanwege de kleine omvang van exosomes, kunnen ze alleen worden direct gevisualiseerd met elektronenmicroscopie, en niet door lichtmicroscopie. Typische morfologische kenmerken van exosomes zijn ronde vorm en 30-100 nm grote membraanblaasjes. In figuur 3, elektronenmicroscopie foto&#39;s tonen exosomes immunostained (A) met goud-gelabeld antilichaam voor CD63 (aangegeven met de pijl) en niet-immunostained exosomes (B). Om vast te stellen dat de geïsoleerde blaasjes inderdaad exosomes en om verder te karakteriseren van de exosomal eiwitten, is Western blot gebruikt. Figuur 4 toont de afwezigheid van calnexin, een endoplasmatisch reticulum marker. Dit duidt op weinig vervuiling van blaasjes van het endoplasmatisch reticulum. Bovendien Figuur 4 toont de aanwezigheid van CD81 in exosomes, dat is een tetraspanine vaak verrijkt met exosomes. Cellulair RNA bevatten voornamelijks ribosomaal RNA (rRNA), gezien als de twee prominente pieken voor de 18S en 28S rRNA subeenheden in een Bioanalyzer analyse (figuur 5A). Echter, exosomal RNA verschillen in hun profiel als exosomes niet de twee pieken rRNA (18S en 28S) en zijn verrijkt met korte RNA, zoals mRNA en miRNA (figuur 5B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" /> Figuur 1. Vanwege de kleine omvang van exosomes (30-100 nm), kunnen ze niet onderscheiden worden van lawaai en achtergrond bij geanalyseerd met flowcytometrie. Daarom is het noodzakelijk om ze te koppelen aan antilichamen gecoate parels voor de exosomes worden geanalyseerd, die vervolgens kunnen worden gevisualiseerd door de laser. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" /> Figuur 2. De exosome-kralen complex kan aggregaat met elkaar en vormen twee-en driepersoons kralen (A). De pijl is het aantonen van de single kraal-exo<html> sommige bevolkingsgroepen die is omheind en gebruikt voor verdere analyse. Deze populatie zal direct worden vergeleken met een isotype controle (gevuld grijs piek) aan de aanwezigheid van membraan moleculen van de exosomes te bepalen. CD63 positieve exosomes (zwart geopend piek) zijn weergegeven in figuur B. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" /> Figuur 3. Electronenmicroscoop van exosomes met de typische morfologie en de grootte (40-80 nm) (A en B). De pijl in figuur A geeft de gouden deeltje van het secundaire antilichaam, na te gaan of deze exosome CD63 hebben op het membraanoppervlak. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" /> Figuur 4. Western blot resultaten waaruit blijkt dat de afwezigheid van het endoplasmatisch reticulum eiwit calnexin maar de aanwezigheid van het eiwit vaak verrijkt met exosomes, tetraspanine CD81. ve_content &quot;&gt; <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" /> Figuur 5. Bioanalyzer resultaten tonen de aanwezigheid RNA in de cellen (A) en exosomes (B). Pijlen geeft de 18S en 28S rRNA subeenheden aanwezig in de cellen. Als exosomal RNA mannelijke bevatten kleine RNA geen of weinig rRNA is geïdentificeerd in exosomes.

<ol>
	<li>Pan, B. -. T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro:+Selective+externalization+of+the+receptor.">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li><li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+immune+properties+and+potential+clinical+implementations.">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions.">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li><li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li><li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li><li>Almqvist, N., L&#246;nnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma.">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li><li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction.">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li><li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine:+dendritic+cell-derived+exosomes.">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li><li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA*008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes.">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function.">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li><li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation:+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R&#945;.">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15R&#945;.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li><li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Derived+Microvesicles+Induce,+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+(Treg).">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li><li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8++T-cell+apoptosis.">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li><li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress;+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA.">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li></ol>

JL is een mede-eigenaar van een patent met betrekking tot het gebruik van exosomes als vectoren voor de overdracht van RNA aan cellen.

Bij het bestuderen van de moleculaire inhoud en / of functie van exosomes, is het cruciaal om een ​​hoge kwaliteit isolatie-methode dat een adequate opbrengst en de laagst mogelijke mate van vervuiling biedt gebruiken. De methodiek zoals beschreven in dit artikel is een gevestigde aanpak voor het isoleren exosomes en om hun RNA-inhoud en biologische functie te bestuderen. Verder wordt het belang van de karakterisering van het geïsoleerde exosomes, door een combinatie van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie, flow cytometrie en Western blot, gemarkeerd. Bij het isoleren exosomes, is de eerste stap centrifugeren (300 xg) gebruikt om de pellet cellen die aanwezig kunnen zijn in de cel schorsing of de onderzochte biologische vloeistof. De tweede centrifugatie bij 16 500 xg moet voldoende sterk zijn om pellet dode cellen, grotere puin, apoptotische lichamen en andere organellen. Na deze centrifugeren, sommige protocollen omvatten een nano-filtratie stap, maar sommige investigators hebben uitgesloten, deze stap. Maar we benadrukken het belang van het uitbannen fragmenten en blaasjes groter dan 200 nm en daarom adviseren inclusief een filtratie stap. Indien een strengere isolatie nodig is, kan 100 nm filters worden gebruikt, maar rekening mee dat als viskeuze vloeistoffen worden gebruikt, deze filters gemakkelijk kunnen worden geblokkeerd en exosomal materiaal verloren gaat. Ook kan een 100 nm filtratie van invloed op de morfologie van de exosomes en voorts indien exosomes bevinden zich op de grotere schaal zij zouden verloren gaan. Zo is de 200 nm filters lijken geschikt voor exosome isolatie. Na de filtratie, is de verplichte ultracentrifugatie bij 120.000 xg gebruikt om de pellet exosomes. De exosomes kan verder worden gewassen met PBS, gebonden aan antilichamen gecoate kralen en gewassen, of op een sucrose gradiënt om vervuiling eiwitten te verwijderen. Dit kan echter een zeer hulpbronnen verbruiken proces dat we beweren niet nodig te zijn, vooral als het uitgangspunt monster volume is klein en / of het RNA-inhoud of de exosomes laag is, als extra stap zal aanzienlijk afnemen van het materiaal verder. Maar, nogmaals, moet de aard van het geïsoleerde blaasjes worden bewezen door de aanwezigheid en afwezigheid van bepaalde eiwitten. Tot op heden is er geen absoluut uniek eiwit marker voor exosomes geïdentificeerd om te controleren of de steekproef exosomes en niets anders bevat. Als gevolg hiervan zijn een combinatie van methoden nodig is om de exosomes, met inbegrip van de bepaling van de grootte en morfologie van de exosomes door elektronenmicroscopie karakteriseren. Ook kan de zuiverheid van het monster bepaald worden met behulp van elektronenmicroscopie, omdat deze methode kan een overzicht van de mate van verontreiniging van het monster, bijvoorbeeld met grotere blaasjes, zoals microdeeltjes, apoptotische lichamen of mobiele puin. Bovendien kan het eiwitgehalte van de exosomes worden bepaald door middel van flowcytometrie en Western blot, en de combinatie van deze twee methoden resulteert in een analyse van zowel het membraan gebonden (bijv. CD63 enCD81) en geïnternaliseerd eiwitten (bv. Tsg101 en Alix) van de exosomes. Detectie van eiwitten verrijkt met exosomes, zoals CD63, Tsg101 en Alix, en de afwezigheid van eiwitten zoals het endoplasmatisch reticulum eiwit calnexin, is een indicatie dat de exosome verrijkte pellet inderdaad exosomes en niet besmetten blaasjes van de andere compartimenten van de cel. Het profiel van de RNA die wordt gedetecteerd in exosomes is fundamenteel anders dan die van de RNA aangetroffen in intacte cellen. Zo exosomal RNA geanalyseerd door Bioanalyzer of in gel op basis van RNA-analyse methoden ontbreken de twee pieken voor de 18S en 28S rRNA subeenheden, die prominent in de analyse van cellulaire RNA. Wij zijn dan ook stellen dat de detectie van significante hoeveelheden rRNA in een monster blijkt dat de geëxtraheerde totaal RNA niet van exosomal oorsprong alleen, en dus dat de isolatie-methode moet worden verbeterd en de kwaliteit verzekerd.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Exosome isolatie </td></tr><tr><td> Optima L-90K Ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Quick-seal ultracentrifuge buizen </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Afhankelijk van de rotor verschillende gebruikte buisjes nodig zijn. Ti70 (342.414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Seal Cordless Tube Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur spuitfilter, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Voor viscose vloeistoffen en / of grote volumes, een vacuüm filtratie-systeem, 0,2 micrometer, van VWR International kan in plaats daarvan worden gebruikt (514-0600). </td></tr><tr><td> Elektronenmicroscopie </td></tr><tr><td> Formvar / carbon coating nikkel grids </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Muis-anti-humaan CD63 </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Final conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Isotype controle; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Final conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Anti-muis IgG Gold Conjugate, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Finale conc: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega Elektronenmicroscoop </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Of gelijkwaardige apparatuur. </td></tr><tr><td> Flowcytometrie </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / sulfaat latex kralen </td><td> Grensvlakken Dynamics </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Antilichaam voor het coaten van de latex bolletjes </td><td></td><td></td><td> Bijvoorbeeld anti-CD63 van BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> Of gelijkwaardige apparatuur. </td></tr><tr><td> IgG uit humaan serum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Antilichamen voor detectie </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Bijvoorbeeld: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) isotype controle (555749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Of gelijkwaardige apparatuur. </td></tr><tr><td> Isolatie van exosomal RNA en RNA-analyse </td></tr><tr><td> miRCURY RNA Isolation Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

Het gebied van exosome onderzoek in volle ontwikkeling, met een dramatische toename in publicaties in de afgelopen jaren. Deze kleine blaasjes (30-100 nm) van endocytische oorsprong werden voor het eerst voorgesteld om te functioneren als een manier voor reticulocyten aan het transferrine-receptor uit te roeien, terwijl rijpen in de erytrocyten een, en werden later de naam exosomes. Exosomes worden gevormd door innerlijke knopvorming van een te late endosomen, het produceren van multivesiculaire organen (MVBs), en zijn vrij in het milieu door fusie van de MVBs met de plasmamembraan 2. Sinds de eerste ontdekking van exosomes, hebben een breed bereik van cellen is aangetoond dat deze blaasjes vrij te geven. Exosomes zijn ook aangetroffen in diverse biologische vloeistoffen, waaronder plasma, nasale lavage vocht, speeksel en moedermelk 3-6. Bovendien is aangetoond dat de inhoud en functie van exosomes hangt af van de oorspronkelijke cel en de omstandigheden waaronder zij worden geproduceerd. Een verscheidenheid van functies zijn demonengeconcentreerd voor exosomes, zoals inductie van tolerantie tegen allergeen 7,8, de uitroeiing van de gevestigde tumoren in muizen 9, inhibitie en activatie van natural killer cellen 10-12, bevordering van differentiatie in T-regulerende cellen 13, stimulatie van T-cel proliferatie 14 en inductie van T cel apoptose 15. Jaar 2007 hebben wij aangetoond dat exosomes vrijkomen uit mestcellen messenger RNA (mRNA) en microRNA (miRNA) bevatten, en dat de RNA kan worden geschuif van de ene cel naar de andere via exosomes. In de ontvangende cellen, werd het mRNA geschuif door exosomes aangetoond worden vertaald in eiwit, wat wijst op een regulerende functie van de overgedragen RNA 16. Verder hebben we ook aangetoond dat exosomes afgeleid van cellen gekweekt onder oxidatieve stress kan tolerantie te induceren tegen verdere stress in ontvangende cellen en dus wijzen op een biologische functie van de exosomal shuttle RNA 17. Celcultuur media en biologische vloeistoffen contain een mengsel van blaasjes en schuur fragmenten. Een hoge kwaliteit isolatie methode voor exosomes, gevolgd door karakterisering en identificatie van de exosomes en hun inhoud, is daarom van cruciaal belang om exosomes onderscheiden van andere blaasjes en deeltjes. Hier presenteren we een methode voor de isolatie van exosomes van beide celcultuurmedium en lichaamsvloeistoffen. Deze isolatie methode is gebaseerd op herhaalde centrifugeren en filtreren stappen, gevolgd door een laatste ultracentrifugatie stap waarin de exosomes zijn pellets. Belangrijke methoden om de exosomes identificeren en karakteriseren van de exosomal morfologie en het eiwitgehalte worden gemarkeerd, met inbegrip van elektron microscopie, flow cytometrie en Western blot. De zuivering van het totaal exosomal RNA is gebaseerd op de spin-kolom chromatografie en de exosomal RNA opbrengst en de grootteverdeling is geanalyseerd met behulp van een Bioanalyzer.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Deze paper toont voor de isolering, zuivering en detectie van exosomes, evenals technieken voor de analyse van hun moleculaire inhoud. Deze methoden zijn aanpasbaar voor exosome isolatie van zowel de media voor celkweek en biologische vloeistoffen, en kan daarna analyse van moleculaire content ook nuttig zijn in functionele studies.

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolatie &amp; Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolatie en karakterisering van microvesicles uit perifeer bloed

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...