Name: isolation and characterization of rna-containing exosomes
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00
Duration: 9 min 43 s
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この研究は、スウェーデンの研究評議会（K2008 - 57X - 20 676-01-3）によって賄われた。

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	<li>Pan, B. -. T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro:+Selective+externalization+of+the+receptor.">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li><li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+immune+properties+and+potential+clinical+implementations.">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. 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Immunol. 17, 879-887 (2005).</li><li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li><li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li><li>Almqvist, N., L&#246;nnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma.">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li><li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction.">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li><li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine:+dendritic+cell-derived+exosomes.">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li><li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA*008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes.">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function.">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li><li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation:+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R&#945;.">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15R&#945;.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li><li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Derived+Microvesicles+Induce,+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+(Treg).">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li><li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8++T-cell+apoptosis.">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li><li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress;+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA.">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li></ol>

JLは、細胞へのRNAの転送のためのベクターとしてエクソソームの利用に関連する特許の共同所有者です。

分子コンテンツおよび/またはエクソソームの機能を研究するとき、それは適切な収率と汚染の可能な限り低い学位を提供する高品質の単離法を使用することが重要です。このホワイトペーパーで説明されている方法論は、エクソソームを分離し、それらのRNA含有量と生物学的機能を研究するための十分に確立されたアプローチです。さらに、孤立エクソソームの特性評価の重要性は、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットを含むさまざまな方法の組み合わせによって、強調表示されます。 エクソソームを分離する場合、最初の遠心分離工程（300 × gでは）細胞懸濁液または調査生物学的流体中に存在する可能性のある細胞をペレット化するために使用されます。ペレット死細胞、大きい破片、アポトーシス小体や他の細胞小器官に十分に強いものに16 500 × gでのニーズの第二遠心分離。この遠心分離の後、一部のプロトコルは、ナノろ過工程が、いくつかINVが含まれていますestigatorsは、このステップを除外している。しかし、我々は200nmよりも大きいの根絶の断片と小胞の重要性を強調するため、強く、濾過工程を含めることをお勧めします。より厳格な分離が必要な場合は、100nmのフィルターが使用されますが、高粘性流体が使用されている場合、これらのフィルタを簡単にブロックになることができるとexosomal材料が失われることに注意することができます。また、100nmのろ過は、エクソソームの形態に影響を与える可能性がありますし、さらにエクソソームが大規模にある場合、それらが失われる可能性があります。従って、200nmのフィルターは、エキソソーム分離に適しているようです。濾過後、120,000 xgで必須の超遠心分離は、ペレットエクソソームするために使用されます。エクソソームは、さらに抗体被覆ビーズに結合し、洗浄し、PBSで洗浄し、または汚染のタンパク質を除去するために、ショ糖勾配上に配置することができます。しかし、これはスタートサンプル量が小さいと/またはRNA含有量Oの場合は特に、我々は必要ではないと主張することは非常にリソースがかかる可能性がありますFエクソソームは、余分な手順は、実質的にさらに材料を減らすので、低いです。しかし、再び、隔離された小胞の性質は、特定のタンパク質の存在下および非存在によって証明されるべきである。 日付に、エクソソームには絶対的にユニークなタンパク質マーカーは、サンプルがエクソソーム、それ以外のものが含まれていることを確認するために同定されていない。その結果、方法の組み合わせは、電子顕微鏡によるエクソソームの大きさと形態の決定を含むエクソソームを、特徴づけるために必要とされています。このメソッドはそのような微粒子、アポトーシス小体や細胞の破片などの大規模な小胞、と例えば、サンプルの汚染のレベルの概要を提供することができるとしても、サンプルの純度は、電子顕微鏡によって測定することができる。また、エクソソームのタンパク質含有量（例えばCD63を結合した​​膜の両方の分析でフローサイトメトリーとウェスタンブロット法、及びこれら二つのメソッドの結果の組み合わせによって決定することができるとCD81）とエクソソームの内部化タンパク質（例えばTsg101とアリックス）。このようなCD63、Tsg101とアリックス、そしてそのような小胞体蛋白質カルネキシンのようなタンパク質の欠如など、エクソソーム、に富むタンパク質の検出は、エキソソーム濃縮ペレットが実際にエクソソームと細胞の他の区画からではない汚染する小胞であることを示しています。 エクソソームで検出されるRNAのプロファイルは、無傷の細胞で検出されたRNAのそれと根本的に異なっている。従って、バイオアナライザでまたはゲルベースの​​RNAの解析手法で分析したexosomal RNAは、細胞のRNAの解析において顕著な18Sと28S rRNAのサブユニット、の2つのピークを欠いている。したがって、サンプルのrRNAのいずれかのかなりの量の検出は、分離の方法が改善し、品質を保証する必要があることをこのように抽出したtotal RNAは単独でexosomal起源ではないことを示す、と主張する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> エキソソーム分離 </td></tr><tr><td>オプティマL - 90K超遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td>クイックシールの超遠心管</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td>別のチューブを使用するローターに応じて必要とされる。 Ti70（342414）、Ti45（345776） </td></tr><tr><td>クイックシールコードレスチューブトッパーキット</td><td>ベックマンコールター</td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropurシリンジフィルター、0.20μm </td><td>ザルスタット</td><td> 83.1826.001 </td><td> VWRインターナショナルからビスコース液体および/または大容量、真空ろ過システム、0.2μmの、のために（514〜0600）の代わりに使用することができます。 </td></tr><tr><td> 電子顕微鏡法 </td></tr><tr><td> Formvar /カーボンコーティングされたニッケルグリッド</td><td>テッドペラ株式会社</td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD63 </td><td>バイオサイエンスBD </td><td> 556019 </td><td>最終濃度：0.05μg/μl </td></tr><tr><td>アイソタイプコントロール、IgG1κ（MOPC 21） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M9269 </td><td>最終濃度：0.05μg/μl </td></tr><tr><td>抗マウスIgG金共役、10nmの</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7777 </td><td>最終濃度：1％ </td></tr><tr><td> LEO 912ABオメガ電子顕微鏡</td><td>カールツァイスNTS </td><td></td><td>または同等の装置。 </td></tr><tr><td> フローサイトメトリー </td></tr><tr><td> 4μmaldehyd /硫酸塩ラテックスビーズ</td><td>界面動力学</td><td> 12から4000 </td><td></td></tr><tr><td>ラテックスビーズのコーティング用抗体</td><td></td><td></td><td>バイオサイエンスBD（556019）からの例の抗CD63用</td></tr><tr><td>インテリミキサーRM - 2L </td><td> ELMI </td><td></td><td>または同等の装置。 </td></tr><tr><td>ヒト血清からのIgG </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td>検出用抗体</td><td>バイオサイエンスBD </td><td></td><td>たとえば、次のようにPE抗CD63（556020）PE抗CD9（555372）PE、抗CD81（555676）アイソタイプコントロール（555749） </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td>バイオサイエンスBD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ウエスタンブロット法 </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td>または同等の装置。 </td></tr><tr><td> exosomal RNAとRNA解析の分離 </td></tr><tr><td> miRCURY RNAアイソレーションキット</td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilentの2100バイオアナライザ</td><td>アジレントテクノロジー</td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

エキソソーム研究の分野は近年急速に出版物の劇的な増加と、拡大しています。エンドサイトーシスの起源のこれらの小胞は（30〜100 nmの）最初の赤血球1に成熟しながら、網状赤血球は、トランスフェリン受容体を根絶するための手段として機能するように提案し、後で名前エクソソームであった。エキソソームは、多胞体（MVBs）の製造、後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、原形質膜2 MVBsの融合により、環境中に放出されています。エクソソームの最初の発見以来、セルの広い範囲は、これらの小胞を放出することが示されている。エキソソームは、プラズマ、鼻洗浄液、唾液や母乳3月6日を含むいくつかの生物学的流体、検出されている。さらに、それはエクソソームの内容と機能は元の細胞とそれらが生成される条件に依存することが実証されている。様々な機能が悪魔となっているT細胞増殖14の刺激、制御性T細胞にそのようなアレルゲン7,8に対する寛容の誘導など、エクソソーム、、マウス9の確立された腫瘍の撲滅、ナチュラルキラー細胞10-12の抑制と活性化、分化の促進13のtratedとT細胞のアポトーシス15の誘導。 2007年に我々は、肥満細胞から放出さエクソソームは、メッセンジャーRNA（mRNA）とマイクロRNA（miRNAを）含んでいる、とRNAが1つのセルからエクソソームを経由して別のに往復することができるということを示した。レシピエントの細胞では、エクソソームで往復mRNAを転送RNA 16の調節機能を示唆し、タンパク質に翻訳されることが示された。さらに、我々はまた、酸化ストレス下で増殖した細胞から派生したエクソソームは、レシピエント細胞にさらなるストレスに対する耐性を誘導するため、exosomalシャトルRNA 17の生物学的機能を提案できることが示されている。細胞培養培地や生体液のCO小胞の混合物をntainとフラグメントを流した。エクソソームのための高品質の単離法は、特性評価およびエクソソームとそのコンテンツの識別に続いて、したがって、他の小胞と粒子からエクソソームを区別するために不可欠です。ここで、我々は、細胞培養の培地や体液の両方からエクソソームの単離のための方法を提示する。この分離法はエクソソームはペレット化されている最後の超遠心分離のステップに続いて、繰り返しの遠心分離やろ過のステップに基づいています。エクソソームを特定し、exosomal形態及び蛋白質含量を特徴づける重要なメソッドは、電子顕微鏡、フローサイトメトリーとウェスタンブロット法を含めて、強調表示されます。トータルexosomal RNAの精製はスピンカラムクロマトグラフィーに基づいており、exosomal RNAの収量とサイズ分布は、バイオアナライザを用いて分析される。

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Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

本論文では、エクソソームの単離、精製および検出のための方法、ならびにそれらの分子量の分析のためのテクニックを示しています。これらのメソッドは、細胞培養液や体液の両方からエキソソーム分離のための適応であり、分子量の分析を越えても機能的研究に役立ちます。

RNA含有エキソソームの単離と解析

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

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成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

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Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

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Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

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Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

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