Name: isolation and characterization of rna-containing exosomes
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Это исследование финансировалось шведским исследовательским советом (K2008-57x-20 676-01-3).

<ol>
	<li>Pan, B. -. T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro:+Selective+externalization+of+the+receptor.">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li><li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+immune+properties+and+potential+clinical+implementations.">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions.">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li><li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li><li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li><li>Almqvist, N., L&#246;nnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma.">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li><li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction.">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li><li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine:+dendritic+cell-derived+exosomes.">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li><li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA*008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes.">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function.">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li><li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation:+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R&#945;.">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15R&#945;.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li><li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Derived+Microvesicles+Induce,+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+(Treg).">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li><li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8++T-cell+apoptosis.">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li><li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress;+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA.">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li></ol>

JL является совладельцем патента, связанных с использованием экзосом в качестве векторов для переноса РНК к клеткам.

При изучении молекулярной содержание и / или функции экзосом, очень важно использовать метод изоляции высоким качеством, что обеспечивает соответствующую доходности и низкой степени загрязнения. Методологии, описанной в этой статье является хорошо организованной подход для выделения экзосом и изучать их содержание РНК и биологические функции. Кроме того, важность характеристик изолированных экзосом, путем сочетания различных методов, в том числе электронной микроскопии, проточной цитометрии и Вестерн-блот, будет выделен. При изоляции экзосом, первый шаг центрифугирования (300 мкг) используется для осаждения клеток, которые могут присутствовать в суспензии клеток или изучал биологические жидкости. Второго центрифугирования при потребности 16 500 мкг быть достаточно сильным, чтобы гранулы мертвых клеток, больше мусора, апоптотических тел и других органелл. После этого центрифугирования, некоторые протоколы включают нано-фильтрации шаг, но некоторые инвestigators исключили этот шаг. Тем не менее, мы подчеркиваем важность искоренения фрагменты и пузырьки больше 200 нм, и поэтому настоятельно рекомендую в том числе фильтрация шаг. Если более жесткие изоляция необходима, 100 нм, фильтры могут быть использованы, но учтите, что если вязких жидкостей используются, эти фильтры могут легко стать заблокирован и exosomal материала теряется. Кроме того, 100 нм фильтрации может повлиять на морфологию экзосом, а тем более, если экзосом находятся на большем масштабе они могут быть потеряны. Таким образом, фильтры 200 нм представляется целесообразным для exosome изоляции. После фильтрации, обязательные ультрацентрифугирования в 120000 мкг используется для гранул экзосом. Экзосом могут быть дополнительно промывают PBS, связанных с антителами покрытые бисером и промывают, или разместить на градиенте сахарозы для удаления загрязнения белков. Однако, это может быть очень ресурсоемкой процесс, который мы утверждаем, что нет необходимости, особенно если начать объему образца мала и / или содержание РНК ое экзосом низкий, как дополнительные шаги будут существенно снизить материала в дальнейшем. Однако, опять же, характер изолированных везикул должно быть доказано наличие и отсутствие определенных белков. На сегодняшний день нет абсолютно уникальный белок маркером экзосом был идентифицирован чтобы убедиться, что образец содержит экзосом и больше ничего. В результате сочетания методов необходимо, чтобы охарактеризовать экзосом, в том числе определение размера и морфологии экзосом помощью электронного микроскопа. Кроме того, чистота образцов может быть определено с помощью электронной микроскопии, так как этот метод может обеспечить обзор уровня загрязнения образцов, например с более крупными пузырьками, такие, как микрочастицы, апоптотических тел или клеточных обломков. Кроме того, содержание белка в экзосом можно определить по проточной цитометрии и иммуноблоттинг и сочетание этих двух методов приводит анализ как мембраносвязанных (например, CD63 иCD81) и внутренним белки (например Tsg101 и Аликс) в экзосом. Обнаружение белков обогащенного экзосом, такие как CD63, Tsg101 и Аликс, и отсутствие белков, таких как эндоплазматическая сеть белка calnexin, является признаком того, что exosome обогащенного гранулы действительно экзосом и не загрязнять пузырьки из других отсеков ячейки. Профиль РНК, которая обнаруживается в экзосом в корне отличается от подходов, РНК находится в неповрежденных клетках. Таким образом, exosomal РНК проанализированы Bioanalyzer или гель подходы, основанные на РНК анализа отсутствие двух пиков для 18S и 28S рРНК подразделения, которые занимают видное место в анализе клеточных РНК. Поэтому мы утверждать, что обнаружение каких-либо значительных количеств рРНК в пример показывает, что общая РНК извлеченные не из exosomal происхождения одиночку, и, таким образом, что метод изоляции должно быть улучшено и качество гарантировано.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (необязательно) </td></tr><tr><td> Exosome изоляции </td></tr><tr><td> Optima L-90K ультрацентрифуге </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Быстрая печать труб ультрацентрифуге </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> В зависимости от ротора использовали различные трубы не требуется. Ti70 (342414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Быстрая печать Беспроводной комплект труб Топпер </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Шприц фильтр, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Для вискозных жидкостей и / или больших объемов, система вакуумной фильтрации, 0,2 мкм, от VWR International можно использовать вместо (514-0600). </td></tr><tr><td> Электронная микроскопия </td></tr><tr><td> Формвар / углерода покрытием сетки никеля </td><td> Тед Пелла Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Мышь-анти-CD63 человека </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Заключительные конц: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Изотип контроля; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Заключительные конц: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Анти-IgG мыши Золотой конъюгат, 10 нм </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Заключительные конца: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Омега электронного микроскопа </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Или эквивалент оборудования. </td></tr><tr><td> Проточная цитометрия </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / сульфат латекса бисером </td><td> Динамика межфазной </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Антитела для покрытия бусин латекса </td><td></td><td></td><td> Например анти-CD63 с BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> Или эквивалент оборудования. </td></tr><tr><td> IgG из сыворотки крови человека </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Антитела для обнаружения </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Например: ЧП анти-CD63 (556020) PE анти-CD9 (555372) PE анти-CD81 (555676) Изотип управления (555749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Вестерн-блот </td></tr><tr><td> Трансзвуковой T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Или эквивалент оборудования. </td></tr><tr><td> Выделение exosomal РНК и РНК анализа </td></tr><tr><td> miRCURY РНК Изоляция Kit </td><td> Exiqon / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Компания Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Эта статья демонстрирует методы выделения, очистки и обнаружения экзосом, а также методы анализа их молекулярной содержания. Эти методы могут быть адаптированы для exosome изоляции от обеих культуры клеток и биологических жидкостей, и может за анализ молекулярных содержание также может быть полезно в функциональных исследований.

Выделение и характеристика РНК-содержащих экзосом

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Изоляция и характеристика Hoechst Низкий CD45 Отрицательный Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Изоляция, культура и функциональная характеристика взрослой мыши Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Выделение и характеристика Микровезикулы из периферической крови

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Изоляция, характеристика и дифференцировка сердца стволовых клеток от сердца взрослого мыши

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Изоляция и характеристика взрослых сердечных фибробластов и миофибробластов

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Выделение и характеристика экзосом фибробластов скелетных мышц

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Выделение и характеристика первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Выделение и характеристика интактной фикобилисомы в цианобактериях

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Выделение и характеристика цианобактериальных внеклеточных везикул

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...