Name: isolation and characterization of rna-containing exosomes
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00
Duration: 9 min 43 s
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Este estudio fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación (K2008-57X-20 676-01-3).

1. Aislamiento exosoma <ol><li> Se cultivan las células en un medio con exosoma libre de suero. Por lo tanto, cualquier suero añadido al medio de cultivo celular deberá ser agotado de exosomas por ultracentrifugación a 120 000 xg durante la noche a 4 ° C antes de su uso. </li><li> Transferencia de la suspensión celular a tubos cónicos. </li><li> Centrifugar a 300 g durante 10 minutos a 4 ° C para que sedimenten las células. </li><li> Transferir el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga y si no está completamente lleno PBS agrega. </li><li> Centrifugar la muestra a 16 500 g durante 20 minutos a 4 ° C para eliminar más células y restos celulares. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras para eliminar las partículas mayores de 200 nm. </li><li> Transferir el sobrenadante se filtra a los tubos de ultracentrífuga nuevo y sellado de los tubos antes de ultracentrifugación a 120 000 xg durante 70 minutos a 4 ° C para que sedimenten las exosomas. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para la recuperación de exosoma máximo, volver a suspender el enriquecimiento exosomaed pellet en varias ocasiones en un volumen pequeño (3 x 50 l) de una solución amortiguadora. Este buffer depende de los experimentos posteriores previstas tras el aislamiento exosoma. Por ejemplo, un tampón de lisis se utiliza para la proteína y el aislamiento de ARN, PBS se utiliza para la microscopía electrónica y citometría de flujo y por medio de los estudios funcionales pueden ser preferibles. </li></ol> Nota: exosomas también se puede aislar de diferentes fluidos corporales, tales como el plasma, utilizando el mismo procedimiento que para los medios de cultivo celular. Para fluidos viscosos, puede ser necesario diluir la muestra con PBS antes de la centrifugación y filtración. En relación con la velocidad de centrifugación para el punto 5, se puede aumentar a 29 500 xg, y la ultracentrifugación en el punto 7 se puede ampliar a 90 minutos 18. Si la muestra tiene que ser purificado el exosoma pellet se puede flotar en un gradiente de sacarosa y de los exosomas principalmente se encuentra en la fracción representing una densidad de 1,13-1,19 g / ml 2. 2. Identificación exosoma por microscopía electrónica <ol><li> A fin de eliminar las proteínas contaminantes, resuspender el pellet exosoma enriquecido en PBS y ultracentrifugación a 120 000 xg durante 70 minutos a 4 ° C para volver a precipitar las exosomas. </li><li> Tome una pequeña alícuota de la muestra para el aislamiento de la proteína y la medición de proteínas totales. Asegúrese de que sólo una pequeña parte de la muestra se lisaron y se utiliza para la medición de la proteína y mantener intacta la exosomas, resuelto en PBS, por separado o en el hielo a -80 ° C para experimentos adicionales. </li><li> Ponga una gota, aproximadamente 10 g de proteína exosomal de los exosomas intacta resuspendido en PBS, en una Parafilm. Luego, con pinzas, suavemente la posición de una rejilla de carbono recubiertos de níquel formvar en la parte superior de cada gota durante 30-60 minutos. Asegurar que la red se coloca con el lado frente a la caída de recubrimiento que contiene exosomas. </li><li> Coloque tres gotas, cada 30 l de PBS en tque Parafilm y lavar la red de forma secuencial el posicionamiento de la rejilla en la parte superior de las gotas de PBS, y el uso de un papel absorbente en el medio. Utilice el papel absorbente con cuidado sólo por la celebración de cerca a un lado de la red, sin hacer contacto con la superficie recubierta. </li><li> Fijar la muestra a través de depósito una caída de 2% de paraformaldehído en el Parafilm y el lugar de la red en la parte superior de la gota durante 10 minutos. </li><li> Repita el paso de lavado en el punto 4, antes de la inmunotinción con un anticuerpo apropiado. Anticuerpos utilizados son anti-CD63 y anti-MHC de clase II. La microscopía electrónica también se puede realizar sin inmunotinción como exosomas se pueden identificar exclusivamente en función del tamaño y morfología. Sin embargo, se recomienda para evaluar el tamaño, la morfología y la presencia de una proteína de membrana para una validación más concluyentes. </li><li> Transferencia de la red a una caída de 30 l del anticuerpo primario de elección y se incuba durante 40 minutos. Lavar a repetir el punto 4, pero el uso de 0,1% de albúmina sérica bovina en PBS en lugar de PBS. </li><li> Repita el punto 7, pero con los 10 nm de oro y anticuerpo secundario marcado y lavar con PBS solo. </li><li> Después de fijar la muestra mediante la adición de una caída de 2,5% de glutaraldehído al Parafilm e incube la rejilla en la parte superior de la gota durante 10 minutos. Repita el lavado en el punto 4, pero el uso de cinco gotas de agua desionizada en lugar de tres gotas de PBS. </li><li> Contraste de la muestra mediante la adición de una gota de acetato de uranilo al 2% a la Parafilm e incube la red en la parte superior de la caída durante 15 minutos. </li><li> Integrar la muestra mediante la adición de una gota de metilcelulosa al 0,13% y el 0,4% de acetato de uranilo al Parafilm e incube la red en la parte superior de la gota durante 10 minutos. </li><li> Retire el exceso de líquido con cuidado utilizando un papel absorbente, antes de colocar la rejilla en un papel con la cara cubierta y dejar secar al aire durante 5 minutos. </li><li> Examinar las preparaciones con un microscopio electrónico o tienda de las redes en una celda de la malla para el trabajo futuro. </li></ol> 3.Caracterización exosoma por citometría de flujo Como exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por el equipo actual de la citometría de flujo, es necesario unir primero los exosomas a cuentas recubiertas de anticuerpos (Figura 1). Estas cuentas pueden ser adquiridos como un producto ya hecho o en el laboratorio con el anticuerpo de elección. Dependiendo del origen celular exosomal, diferentes anticuerpos se pueden acoplar a los granos que pueden ser de carácter magnético o al látex. En la actualidad el uso anti-MHC de clase II o anti-CD63 bolas recubiertas de este análisis. <ol><li> Para el uso de los granos &quot;casera&quot; recubiertas de anticuerpos, utilizamos cuatro bolas de látex recubiertas con anticuerpos anti m-CD63 anticuerpos. Lavar 25 l 4 bolas de látex m (30 x 10 6 bolas) dos veces en 100 l tampón MES, 3 000 g durante 15-20 minutos y disolver el precipitado en 100 l tampón MES. Prepare la mezcla de anticuerpos que contiene un volumen igual de anticuerpo 12,5 mg con el mismo volumen de tampón MES. Agregue elcuentas a la mezcla de anticuerpos e incubar con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Lave las cuentas recubiertas de anticuerpos tres veces con PBS (3 000 g durante 20 minutos) y disolver el precipitado en 100 l de buffer de almacenamiento (con una concentración final de 300 000 cuentas / l). </li><li> Para cada muestra (cada anticuerpo), continuar con un volumen equivalente a un mínimo de 30 g de proteína exosomal (de los exosomas intacta resuelto en PBS) por ~ 100 000 perlas recubiertas de anticuerpos. </li><li> Incubar exosomas y cuentas, en un volumen total de 300 l de PBS, durante la noche a 4 ° C en el movimiento suave. </li><li> Bloque mediante la adición de 300 l de 200 mM glicina y se incuba durante 30 minutos. </li><li> Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado (suero de 1-3% en PBS), 600 g durante 10 minutos. </li><li> Incubar los complejos exosoma de perlas con 50 l de anticuerpos IgG a 4 ° C. Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado como se describe en el paso 5. </li><li> Añadir 90 l de solución de lavado y 10 lanticuerpos de la elección (lo ideal es anti-CD9 y anti CD63-CD81 o anti-) a los complejos exosoma de perlas y se incuba durante 40 minutos con movimientos suaves. Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado como se describe en el paso 5. </li><li> Añadir 300 l de solución de lavado y adquirir datos mediante citometría de flujo. </li></ol> Como se discutió cuentas anteriores, se pueden utilizar diferentes, tales como bolas de látex como se describe en el protocolo o partículas magnéticas. Si las bolas magnéticas se utilizan en su lugar, tenga en cuenta, que el protocolo es un poco diferente. El paso de bloqueo (punto 4) no es necesaria y el lavado se realiza colocando el tubo en un soporte magnético en lugar de una centrifugación. El buffer de almacenamiento utilizadas para las cuentas de &quot;fabricación casera&quot; recubiertas de anticuerpos, contiene 0,1% de glicina y sodio al 0,1% azid en PBS, con un pH de 7,2. Importante, asegúrese de utilizar el suero exosoma agotadas para el buffer de flujo de lavado de citometría de flujo (1-3% de suero en PBS), para evitar cualquierexosomas suero contaminantes en el análisis. Nota: al realizar la caracterización mediante el uso de anticuerpos exosoma cuentas junto es importante reconocer que es sólo una subpoblación específica, específica para los anticuerpos utilizados, es decir, aislado y caracterizado. 4. Detección exosoma por Western blot Western blot es un método bien establecido y no vamos a entrar en detalles sobre el método en sí, sino que se centran en la importancia de un adecuado aislamiento de las proteínas antes de la Western blot y los diferentes anticuerpos utilizados. <ol><li> Disolver la pastilla exosoma en el tampón de lisis de proteínas de la elección y pipeteo fondo, seguido por vórtice de mezclas. A fin de lisar los exosomas, sonicar la muestra en un baño de agua de 3 x 5 minutos con el vórtice de mezcla en el medio. Finalmente centrifugación de la muestra, 13 000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, y la transferencia del sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf. </li><li> Measuvolver a la proteína total por el método de elección y la carga de 20-50 g de proteína por cada pozo. </li><li> Separada y la transferencia de las proteínas mediante electroforesis en gel y electrotransferencia. </li><li> Bloquear y lavar la membrana antes de realizar la inmunotinción frente a las proteínas enriquecido en exosomas. </li><li> Detectar la proteína específica por quimioluminiscencia, sistema de imagen digital y software de análisis. </li></ol> Como no hay marcadores específicos exosoma, las proteínas que se enriquecen en los exosomas, de todos los orígenes celulares diferentes, se utilizan comúnmente para la detección de exosomas. Estas son las proteínas, tales como tetraspaninas (por ejemplo, CD9, CD63 y CD81), proteína del citoesqueleto asociados (por ejemplo, Ezrin) y proteínas implicadas en la biogénesis multivesiculares (por ejemplo, Tsg101 y Alix). Otras proteínas que también son comúnmente detectado en los exosomas son Flotillin, Hsc70 y diferentes proteínas Rab, etc Sin embargo, también hay células proteínas específicas que se encuentran en los exosomas como A33 (células epiteliales del intestino), CD3(Células T) y el MHC de clase II (células presentadoras de antígenos). Así, dependiendo de qué tipo de células a partir de los exosomas son liberados de los marcadores para la detección puede variar. Como otros compartimientos de la célula también puede producir vesículas, se recomienda también para determinar la presencia de proteínas de estos compartimentos como el retículo endoplasmático (por ejemplo, calnexina y grp78) y el aparato de Golgi (por ejemplo, GM130). Por lo tanto, la falta de estas proteínas indica poca o ninguna contaminación de las vesículas de otros compartimentos de la muestra estudiada. 5. El aislamiento de ARN exosomal y análisis de ARN <ol><li> Disolver la pastilla exosoma en el tampón de lisis de ARN de la elección y llevar a cabo la extracción de RNA. Diferentes kits de aislamiento de ARN se pueden utilizar dependiendo de los experimentos posteriores, pero los métodos basados ​​en la columna proporciona muestras con un espectro más amplio de la ARN. Actualmente estamos utilizando miRCURY kit de aislamiento de ARN Exiqon, pero otros equipos pueden ser adecuados en función de la scientific cuestión que nos ocupa. </li><li> Al realizar el aislamiento de ARN es importante trabajar en un ambiente libre de RNasa. Por lo tanto el uso de ácidos nucleicos y nucleasa consejos gratis pipeta y limpie tanto banquillo y el equipo libre de contaminantes y RNasas. </li><li> Para el aislamiento de ARN, mediante el uso de miRCURY kit de aislamiento de ARN, disolver el exosoma pellet en 350 l de solución de lisis y realizar vórtice de la mezcla durante 15 segundos. </li><li> Añadir 200 l de etanol al 95% y agitar la mezcla durante 10 segundos. </li><li> Coloque una columna en un tubo de recogida y transferencia de los exosomas lisis de la columna y centrifugar 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Lavar tres veces añadiendo 400 l de solución de lavado a la columna que contiene el ARN exosomal y centrifugar durante 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Centrifugar la columna durante 2 minutos a 14 000 xg para asegurarse de que la columna se seque y coloque la columna seca en un tubo libre de RNasa eppendorf. </li><li> Añadir 50 l de Tampón de Elución de la columna y centrifugar durante 2<html> minutos a 200 xg, seguido por 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Continuar con el ARN aislado o almacenarlo en -80 ° C. </li></ol> Para la detección y análisis de la ARN extraído exosomal total, use un Agilent 2100 Bioanalyzer con el ARN Nano 6000 o Kit ARN 6000 Pico. El análisis muestra que el rendimiento exosomal ARN y distribución de tamaño. 6. Resultados representante Los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por los métodos disponibles de citometría de flujo, y por lo tanto unido al anticuerpo revestida de piedras antes de ser analizados (Figura 1). Como exosoma de perlas complejos puede agregar la citometría de flujo diagrama de dispersión puede contener diferentes poblaciones de cuentas individuales, dobles y triples (Figura 2A). La flecha indica las cuentas individuales que se analizan más. A CD63 positivo solo grano-exosoma población en comparación con su control de isotipo se muestra en la Figura 2B. e_content &quot;&gt; Debido al pequeño tamaño de los exosomas, que sólo se pueden visualizar directamente con el microscopio electrónico, y no por microscopía de luz. típicas características morfológicas de los exosomas son de forma redonda y 30-100 nm de tamaño vesículas de membrana. En la figura 3, la microscopía electrónica fotografías muestran exosomas immunostained (A) con el oro-anticuerpo marcado para CD63 (indicado por la flecha) y no immunostained exosomas (B). Para determinar que las vesículas aisladas son de hecho los exosomas y para caracterizar las proteínas exosomal, Western blot se usa comúnmente. La figura 4 muestra la ausencia de calnexina, un marcador de retículo endoplásmico. Esto indica poca contaminación de las vesículas del retículo endoplasmático. Por otra parte, la Figura 4 se muestra la presencia de CD81 en los exosomas, que es un tetraspanin comúnmente enriquecidos en exosomas. ARN celular contienen principalmentes del RNA ribosomal (rRNA), visto como los dos picos prominentes para el 18S y 28S rRNA subunidades en un análisis de Bioanalyzer (Figura 5). Sin embargo, el ARN exosomal difieren en su perfil como exosomas carecen de los dos picos rRNA (18S y 28S) y se enriquecen en el ARN corto como ARNm y miRNA (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" /> Figura 1. Debido al pequeño tamaño de los exosomas (30-100 nm), que no se puede distinguir el ruido de fondo y cuando se analizaron por citometría de flujo. Por lo tanto, es necesario para la fijación de perlas recubiertas de anticuerpos antes de los exosomas son analizadas, lo que puede ser visualizado por el láser. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" /> Figura 2. Las cuentas exosoma complejo puede agregar con cuentas dobles y triples entre sí y la forma (A). La flecha está demostrando el único cordón-exo<html> algunos grupos de población que está cerrada y se utiliza para su posterior análisis. Esta población se pueden comparar directamente a un control de isotipo (gris lleno de pico) para determinar la presencia de moléculas de la membrana de los exosomas. CD63 positivo exosomas (pico abierto negro) se muestran en la figura B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías electrónicas de exosomas con la morfología y el tamaño típico (40-80 nm) (A y B). La flecha en el gráfico A se indica la partícula de oro de la secundaria de anticuerpos, verificando que esta exosoma han CD63 en la superficie de la membrana. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" /> Figura 4. Western blot resultados que demuestren la ausencia de la proteína del retículo endoplásmico calnexina pero la presencia de la proteína común enriquecido en los exosomas, tetraspanin CD81. ve_content &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" /> Figura 5. Bioanalyzer resultados muestran la presencia de ARN en las células (A) y exosomas (B). Las flechas indican el 18S y 28S rRNA subunidades presentes en las células. Como exosomal varonil ARN contienen ARN pequeños rRNA poco o nada se identifica en los exosomas.

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JL es una co-propietario de una patente relacionada con la utilización de los exosomas como vectores para la transferencia de ARN en las células.

Al estudiar el contenido molecular y / o la función de los exosomas, es fundamental utilizar un método de aislamiento de alta calidad que proporciona un rendimiento adecuado y el grado más bajo posible de la contaminación. La metodología descrita en este trabajo es un enfoque bien establecido para aislar los exosomas y estudiar su contenido de ARN y función biológica. Por otra parte, la importancia de la caracterización de los exosomas aislados, por una combinación de diferentes métodos, incluyendo la microscopía electrónica, citometría de flujo y Western blot, se pone de relieve. Al aislar los exosomas, en la primera centrifugación (300 xg) se utiliza para precipitar las células que pueden estar presentes en la suspensión de células o el líquido estudiado biológica. La segunda centrifugación a 16 500 xg necesita ser lo suficientemente fuertes para precipitar las células muertas, escombros más grandes, cuerpos apoptóticos y otros organelos. Después de la centrifugación, algunos protocolos incluyen una etapa de nanofiltración, pero algunos investigators han excluido a este paso. Sin embargo, hacemos hincapié en la importancia de los fragmentos de la erradicación y de las vesículas de más de 200 nm, por lo que recomendamos como una etapa de filtración. Si un aislamiento más estrictas que se necesita, a 100 nm filtros se pueden utilizar, pero tenga en cuenta que si se utilizan fluidos viscosos, estos filtros pueden obstruirse y material exosomal se pierde. Además, un sistema de filtración de 100 nm puede afectar a la morfología de los exosomas y, además, si exosomas son a mayor escala que se pueden perder. Por lo tanto, los 200 nm filtros parece apropiado para el aislamiento exosoma. Después de la filtración, la ultracentrifugación obligatoria a 120.000 xg se utiliza para que sedimenten las exosomas. Los exosomas se pueden seguir lavadas con PBS, unida a las microesferas recubiertas de anticuerpo y se lavó, o colocado en un gradiente de sacarosa para eliminar las proteínas contaminación. Sin embargo, esto puede ser un proceso muy lento de los recursos que sostienen que no es necesario, especialmente si el volumen de la muestra inicial es pequeña y / o el contenido de ARN of los exosomas es baja, como medidas adicionales disminuirá sustancialmente el material adicional. Sin embargo, una vez más, la naturaleza de las vesículas aisladas deberían ser probadas por la presencia y la ausencia de ciertas proteínas. Hasta la fecha, ningún marcador de proteínas absolutamente único de los exosomas ha sido identificado para verificar que la muestra contiene exosomas y nada más. Como resultado, una combinación de métodos son necesarios para caracterizar los exosomas, incluida la determinación del tamaño y la morfología de los exosomas por microscopía electrónica. Además, la pureza de la muestra se puede determinar mediante microscopía electrónica, ya que este método puede proporcionar una visión general del nivel de contaminación de la muestra, por ejemplo, con grandes vesículas, como por ejemplo micropartículas, cuerpos apoptóticos o restos celulares. Además, el contenido proteico de los exosomas se puede determinar por citometría de flujo y Western blot, y la combinación de estos dos métodos da como resultado un análisis tanto de la unida a la membrana (por ejemplo, CD63 yCD81) e internalizado las proteínas (por ejemplo, Tsg101 y Alix) de los exosomas. Detección de proteínas enriquecido en los exosomas, como CD63, Tsg101 y Alix, y la ausencia de proteínas tales como el retículo endoplasmático proteína calnexina, es una indicación de que el exosoma pellet enriquecido es de hecho exosomas y no contaminar las vesículas de los otros compartimientos de la célula. El perfil de los ARN que se detecta en los exosomas es fundamentalmente diferente a la del ARN que se encuentran en las células intactas. Por lo tanto, el ARN exosomal analizados por Bioanalyzer o en gel a base de los enfoques de análisis de ARN carecen de los dos picos del 18S y 28S rRNA subunidades, que ocupan un lugar destacado en el análisis del ARN celular. Por lo tanto, argumentan que la detección de cantidades significativas de rRNA en una muestra indica que el ARN total extraído no es de origen exosomal solo, y por lo tanto que el método de aislamiento es necesario mejorar la calidad y la seguridad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Aislamiento exosoma </td></tr><tr><td> Optima L-90K ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Quick-sello de tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Dependiendo del rotor utilizado diferentes tubos se necesitan. Ti70 (342.414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-el sello del tubo inalámbrico Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Filtro de jeringa, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Para fluidos viscosos y / o grandes volúmenes, un sistema de filtración al vacío, 0,2 m, de VWR International se puede utilizar en su lugar (514 a 0600). </td></tr><tr><td> De microscopía electrónica </td></tr><tr><td> Formvar / rejillas de níquel recubierto de carbono </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-CD63 humano </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Final de conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Control de isotipo, IgG1k (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Final de conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> IgG anti-ratón conjugado de oro, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Final de conc: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega microscopio electrónico </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> Citometría de flujo </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / sulfato de látex cuentas </td><td> Dinámica interfacial </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos para el recubrimiento de las perlas de látex </td><td></td><td></td><td> Por ejemplo, anti-CD63 de BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> Elmi </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> IgG de suero humano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Para la detección de anticuerpos </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Por ejemplo: anti-CD63 PE (556.020) PE anti-CD9 (555.372) de control de isotipo anti-CD81 PE (555,676) (555,749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> El aislamiento de ARN exosomal y análisis de ARN </td></tr><tr><td> miRCURY ARN Kit de aislamiento </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

El campo de la investigación exosoma se está expandiendo rápidamente, con un aumento dramático en las publicaciones en los últimos años. Estas pequeñas vesículas (30-100 nm) de origen endocítica se propuso por primera vez de funcionar como una forma de reticulocitos para erradicar el receptor de transferrina, mientras que en los eritrocitos de maduración 1, y fueron nombrados después exosomas. Exosomas se forman por gemación interna de la tarde endosomes, la producción de cuerpos multivesiculares (MVBs), y se liberan en el medio ambiente por la fusión de la MVBs con la membrana plasmática 2. Desde el primer descubrimiento de exosomas, una amplia gama de células se ha demostrado que la liberación de estas vesículas. Exosomas también se han detectado en varios fluidos biológicos, como el plasma, el líquido lavado nasal, saliva y leche materna 3-6. Además, se ha demostrado que el contenido y la función de exosomas depende de la célula de origen y las condiciones en que se producen. Una variedad de funciones han sido los demoniosconcentrada de exosomas, tales como la inducción de tolerancia frente a alergenos 7,8, la erradicación de tumores establecidos en ratones 9, la inhibición y la activación de las células asesinas naturales 10-12, la promoción de la diferenciación en las células T reguladoras 13, la estimulación de la proliferación de células T 14 y la inducción de la apoptosis de las células T 15. Año 2007 se demostró que los exosomas liberados de los mastocitos contienen ARN mensajero (ARNm) y microRNA (miRNA), y que el ARN puede ser trasladado de una celda a otra a través de exosomas. En las células receptoras, el ARNm transportados por exosomas ha demostrado ser traducido a proteínas, lo que sugiere una función reguladora de la ARN transferido 16. Además, también hemos demostrado que los exosomas derivados de las células cultivadas en el estrés oxidativo puede inducir tolerancia frente al estrés adicional en las células receptoras y por lo tanto sugieren una función biológica de la lanzadera exosomal ARN 17. Medios de cultivo celular y co fluidos biológicosntain una mezcla de vesículas y arrojar fragmentos. Un método de aislamiento de alta calidad para los exosomas, seguido por la caracterización e identificación de los exosomas y su contenido, por lo tanto, es crucial distinguir exosomas de otras vesículas y partículas. A continuación, presentamos un método para el aislamiento de los exosomas de ambos medios de cultivo de células y fluidos corporales. Este método de aislamiento se basa en la centrifugación repetida y etapas de filtración, seguida de una etapa ultracentrifugación final en el que los exosomas se precipitan. Métodos importantes para identificar los exosomas y caracterizar la morfología exosomal y contenido de proteína se ponen de relieve, incluso la microscopia electrónica, citometría de flujo y Western blot. La purificación del RNA exosomal total se basa en la cromatografía de columna de giro y el rendimiento exosomal ARN y distribución de tamaño se analizaron mediante un Bioanalyzer.

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Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.

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