Name: isolation and characterization of rna-containing exosomes
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Bu çalışmada, İsveç Araştırma Konseyi (K2008-57x-20 676-01-3) tarafından finanse edilmiştir.

1. Exosome izolasyon <ol><li> Exosome-serum ile orta hücreleri büyütün. Böylece, herhangi bir serum hücre kültür ortamına eklenen 4 gece boyunca 120 000 xg&#39;de exosomes Ultrasantrifügasyon tarafından tüketilmiş olmalıdır ° C kullanmadan önce. </li><li> Konik tüpler için hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de Santrifüj 4 ° C pelet hücreleri. </li><li> Tüpler ultrasantrifüjdeki ve tamamen dolu eklemek PBS süpernatantı aktarın. </li><li> 4 az 20 dakika boyunca 16 500 xg örnek Santrifüj ° C daha fazla hücre ve hücre enkaz kaldırmak için. </li><li> 200 nm den büyük parçacıkların kaldırılması için filtre 0.2 mikron ile süpernatantı Filtresi. </li><li> Yeni ultrasantrifüjdeki tüplere filtrelenmiş süpernatantı aktarın ve 70 dakika için 4 120 000 xg&#39;de ultrasantrifüjdeki önce tüpler mühür ° C exosomes pelet. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> Maksimal exosome alma exosome zenginleştirmek için, tekrar süspansiyonuygun bir tampon küçük bir hacim (~ 3 x 50 ul) tekrar tekrar ed pelet. Bu tampon exosome izolasyon planlanan mansap deneyler bağlıdır. Örneğin, protein ve RNA izolasyonu için kullanılan lizis tamponu, PBS, elektron mikroskobu ve akım sitometri ve fonksiyonel çalışmalar orta tercih edilebilir için kullanılır. </li></ol> Not; exosomes ayrıca hücre kültür ortamı için aynı prosedürü kullanarak, plazma gibi farklı vücut sıvıları, izole edilebilir. Viskoz sıvılar için santrifüj ve filtrasyon adım önce PBS ile örnek sulandırmak için gerekli olabilir. Noktasının üzerinde 5 santrifüj hızı ile ilgili olarak, 29 500 xg artırılabilir, ve 90 dakika 18 nokta 7 Ultrasantrifügasyon kadar uzatılabilir. Örnek daha saflaştırılmış gerekiyorsa exosome pelet sukroz gradient sokulacak ve exosomes fraksiyonu huk öncelikle olacaknting yoğunluğu 1,13-1,19 gr / ml 2. 2. Elektron mikroskobu ile Exosome belirlenmesi, <ol><li> Daha da kirlenmesine neden olan proteinlerin ortadan kaldırılması, 4, 70 dakika için 120 000 xg ° C ile yeniden pelet exosomes exosome zenginleştirilmiş PBS pelet ve ultrasantrifüjdeki tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Küçük bir kısım protein izolasyonu ve total protein ölçümü için örnek ele alalım. Örnek sadece küçük bir parçası, protein ölçümü için parçalanmış ve kullanılan emin olun ve buz üzerinde ayrı ayrı ya da -80 ° C daha fazla deneyler için PBS içinde çözülmesi sağlam exosomes tutmak. </li><li> Bir Parafilm bir damla, PBS içinde yeniden süspanse sağlam exosomes exosomal protein yaklaşık 10 mg, koyun. Sonra, forseps, 30-60 dakika boyunca her damla üstüne formvar karbon kaplı nikel ızgara yavaşça yerleştirin. Izgara exosomes içeren damla karşı karşıya kaplama tarafında konumlandırılmış sağlamak. </li><li> T PBS üç damla, her biri 30 ul, Yero PBS damlacıklarının üstüne sırayla ızgara konumlandırma Parafilm ve ızgara yıkayın ve arasında bir emici kağıt kullanın. Sadece kaplı alanı ile temas yapmadan, ızgara ve yan yakından tutarak hafifçe emici kağıt kullanın. </li><li> Mevduat% 2 paraformaldehid Parafilm bir damla örnek Fix ızgara ve 10 dakika boyunca açılan üst üste yerleştirin. </li><li> Uygun bir antikor ile immün önce 4 nokta yıkama adımı yineleyin. Yaygın olarak kullanılan antikor, anti-CD63 ve anti-MHC sınıf II. Elektron mikroskobu da exosomes sadece boyutu ve morfolojisi dayanarak tespit edilebilir olarak immün olmadan yapılabilir. Ancak, boyutu, morfolojisi ve daha kesin doğrulama için bir membran proteini varlığı değerlendirmek için önerilir. </li><li> Izgara tercih birincil antikor 30 ul damlasına kadar aktarın ve 40 dakika boyunca inkübe edin. Nokta 4 tekrarlayarak yıkayın, ancak PB% 0.1 sığır serum albüminS PBS tek başına yerine. </li><li> Nokta 7 yineleyin, ancak 10 nm-altın etiketli sekonder antikoru ve PBS yalnız ile yıkayın. </li><li> ,% 2.5 lik gluteraldehit Parafilm bir damla ekleyerek örnek Post-düzeltmek ve damla 10 dakika boyunca üst ızgara kuluçkaya yatmaktadır. Noktası 4 yıkama yineleyin, ancak beş deiyonize su damlacıkları yerine PBS üç damlacıkları kullanabilirsiniz. </li><li> Kontrast için% 2 uranil asetat Parafilm bir damla damla 15 dakika boyunca üst üste ekleyerek ve ızgara inkübe örnek. </li><li> Embed Parafilm% 0,13 metil selüloz ve% 0.4 uranil asetat damla ekleyerek örnek ve damla 10 dakika boyunca üst ızgara kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Bir kağıt kaplı yüzü ızgara konumlandırma önce, yavaşça bir emici kağıt kullanarak fazla sıvıyı çıkarın ve 5 dakika boyunca hava kuru sağlar. </li><li> Bir elektron mikroskobu ile hazırlıklarını incelemek veya ızgaraları gelecekte yapılacak çalışmalar için bir ızgara kutusunda saklayın. </li></ol> 3.Flow sitometri ile Exosome karakterizasyonu Exosomes akım sitometri cihaz tarafından tespit edilmesi çok küçük olduğundan, ilk exosomes antikor kaplı boncuklar (Şekil 1) bağlamak için gereklidir. Bu boncuklar ya da hazır bir ürün olarak satın alınan ya da tercih edilen antikor ile yapılan laboratuar olabilir. Exosomal hücresel kökene bağlı olarak, farklı antikorlar, manyetik veya lateks karakter olabilir boncuk akuple edilebilir. Şu anda bu analiz için anti-MHC sınıf II veya anti-CD63 kaplı boncuk kullanın. <ol><li> &quot;Ev yapımı&quot; antikor kaplı boncuk kullanımı için, anti-CD63 antikoru ile kaplı 4 mikron lateks boncuk kullanmayın. 100 ul MES tampon iki kez 25 ul 4 mikron lateks boncuk (30 x 10 6 boncuk), 15-20 dakika boyunca 3 000 xg yıkayın ve 100 ul MES tampon pelet çözülür . MES tamponu aynı hacmi 12.5 mikrogram antikor eşit bir hacim içeren antikor karışımı hazırlayın. Ekleantikor karışımı ve gece boyunca oda sıcaklığında ajitasyon altında inkübe boncuk. PBS (3 000 xg 20 dakika) ile antikor kaplı boncuk üç kez yıkayın ve (300 000 boncuk / ml son bir konsantrasyon ile) 100 ul depolama tampon pelet çözülür. </li><li> Her bir örnek için (her bir antikor) ~ 100 000 antikor kaplı boncuk başına 30 mikrogram exosomal protein (PBS içinde çözülmesi sağlam exosomes) en az eşit bir hacmi ile devam edin. </li><li> 4 gece boyunca, toplam hacmi 300 ul PBS exosomes ve boncuklar inkübe ° C altında nazik bir hareket. </li><li> 30 dakika süreyle 200 mM glisin ve inkübe 300 ul ekleyerek engelleme. </li><li> Iki kez yıkama tamponu exosome boncuk kompleksleri (PBS içinde% 1-3 serumu), 10 dakika için 600 xg yıkayın. </li><li> 4 50 ul IgG antikorları ile exosome boncuk kompleksleri ° C inkübe 5. adımda anlatıldığı gibi iki kez yıkama tamponu exosome boncuk kompleksleri yıkayın. </li><li> 90 ul yıkama tamponu ve 10 ul ekleseçim nazik hareketi altında 40 dakika boyunca exosome boncuk kompleksleri ve inkübe antikoru (anti-anti-CD63 CD9 veya anti-CD81 ideal). 5. adımda anlatıldığı gibi yıkama tamponu exosome boncuk kompleksleri iki kez yıkayın. </li><li> 300 ul yıkama tamponu ekleyin ve flow sitometri kullanarak veri almak. </li></ol> Yukarıda ele alındığı gibi, farklı boncuklar gibi, protokol veya manyetik boncuk açıklandığı gibi lateks boncuk gibi kullanılabilir. Manyetik bilye yerine kullanılması halinde, protokol biraz farklı olduğunu lütfen unutmayın. Engelleme adım (nokta 4) gerekli değildir ve yıkama, santrifüj yerine manyetik bir stand tüp koyarak yapılır. &quot;Ev yapımı&quot; antikor kaplı boncuklar için kullanılan depolama tampon,% 0.1 glisin ve 7.2 pH, PBS içinde azid% 0,1 sodyum içerir. Daha da önemlisi, herhangi bir önlemek için, flow sitometri yıkama tamponu (PBS içinde serum% 1-3) exosome tükenmiş serum kullandığınızdan emin olunanaliz kirlenmesine neden olan serum exosomes. Not; antikor birleştiğinde boncuklar kullanarak exosome karakterizasyonu yaparken sadece izole ve karakterize kullanılan antikor için özel bir özel ICSI&#39;nin olduğunu kabul etmek önemlidir. 4. Western Blot Exosome tespiti Western Blot iyi kurulmuş bir yöntem olduğunu ve yöntemi kendisi ile ilgili detaya gidin, ama Western Blot ve kullanılan farklı antikorlar önce uygun bir protein izolasyonu önemini odaklanmak olmaz. <ol><li> Tercih edilen protein lizis tamponu exosome pelet çözülür ve vorteks karıştırma iyice pipetleme. Exosomes lyse için, bir su banyosunda 3 örnek sonikasyon x 5 dakika arasında girdap karıştırma. Sonunda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13 000 xg örnek santrifüj, ve yeni bir Eppendorf tüpüne süpernatantı transfer. </li><li> Measuyeniden tercih edilen bir yöntem ile total protein ve ortalama 20-50 mg protein yük. </li><li> Ayrı ve proteinler jel elektroforezi ve electroblotting aktarmak. </li><li> Blok ve exosomes olarak zenginleştirilmiş proteinlere karşı immün gerçekleştirmeden önce membran yıkayın. </li><li> Kemilüminesans, dijital görüntüleme sistemi ve analiz yazılımları özel bir protein algılar. </li></ol> Tüm farklı cep telefonu kökenlerden gelen exosome özel işaretleri, exosomes zenginleştirilmiş olan proteinlerin, olduğu gibi, exosome algılama için sık kullanılır. Bunlar tetraspanins (örneğin CD9, CD63 ve CD81), hücre iskeletinin ilişkili protein (örneğin Ezrin) ve multivesicular biyogenezi (örneğin Tsg101 ve Alix) ilgili proteinler gibi proteinlerdir. Ancak, diğer proteinler de yaygın exosomes tespit Flotillin, Hsc70 ve farklı rab proteinler vb A33 (bağırsak epitel hücreleri) gibi exosomes bulundu hücre spesifik proteinlerin, CD3 de vardır(T hücreleri) ve MHC sınıf II (antijen sunan hücreler). Böylece, exosomes tespiti için belirteçler yayımlanan hücre tipine bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Hücrenin diğer bölmeleri de veziküller üretebilir, daha fazla (örneğin calnexin ve Grp78) endoplazmik retikulum ve golgi (örneğin GM130) olarak bu bölmeleri proteinlerin varlığını belirlemek için tavsiye edilir. Böylece, bu proteinlerin eksikliği okudu örnek diğer bölmeleri veziküller ya hiç ya da çok az kirlenme gösterir. 5. Exosomal RNA ve RNA analiz izolasyonu <ol><li> Seçim RNA lizis tamponu exosome pelet çözülür ve RNA çekimini gerçekleştirebilecek. Farklı RNA izolasyon kitleri mansap deneyler bağlı olarak kullanılan, ancak sütun tabanlı yöntemler RNA daha geniş bir spektrum sağlar örnekleri olabilir. Şu anda Exiqon miRCURY RNA İzolasyon Kiti kullanarak, ancak diğer kitleri sc bağlı olarak uygun olabilireldeki ientific soru. </li><li> RNA izolasyonu yaparken RNaz özgür bir ortamda çalışmak için önemlidir. Bu nedenle, nükleik asit ve nükleaz pipet uçları kullanımı ve ücretsiz tezgah ve ekipman hem de kirleticiler ve RNases silin. </li><li> RNA izolasyonu için, miRCURY RNA İzolasyon Kiti kullanarak, 350 ul lizis çözüm exosome pelet çözülür ve 15 saniye boyunca girdap karıştırma gerçekleştirebilirsiniz. </li><li> % 95 etanol ve vorteks karıştırma 10 saniye boyunca 200 ul ekleyin. </li><li> Bir toplama tüpüne koyun ve bir sütun sütun parçalanmış exosomes transferi ve 14 000 x g. 1 dakika santrifüj </li><li> 1 dakika 14 000 x g. exosomal RNA ve santrifüj içeren sütun Yıkama Çözeltisi 400 ul ekleyerek üç kez yıkayın </li><li> Sütun, sütun kuru ve kuru bir RNaz-free Eppendorf tüp sütun emin olmak için 14 000 xg 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> 2 sütun ve santrifüj 50 ul Elüsyon Tampon ekle<html> 200 xg&#39;de dakika, 14 000 x g. az 1 dakika takip </li><li> Izole RNA ile devam edin ya da -80 depolamak ° C </li></ol> Tespiti ve analizi için çıkarılan toplam exosomal RNA, RNA 6000 Nano veya RNA 6000 Pico Kit ile bir Agilent 2100 Bioanalyzer kullanın. Analizi exosomal RNA verim ve boyut dağılımı gösterir. 6. Temsilcisi Sonuçlar Exosomes flow sitometri yöntemleri ile tespit edilemeyecek kadar küçük ve bu nedenle (Şekil 1) analiz edilmeden önce, antikor kaplı boncuk bağlı . Exosome boncuk kompleksleri agrega gibi tek, çift ve üçlü boncuk flow sitometri scatter plot farklı popülasyonlar (Şekil 2A) içerebilir. Ok daha fazla analiz tek boncuk gösterir. Izotip kontrol ile karşılaştırıldığında CD63 pozitif tek boncuk exosome nüfus Şekil 2B gösterilmiştir. Şekil 3, elektron mikroskobu e_content &quot;&gt; exosomes küçük boyutu sayesinde, sadece elektron mikroskobu, ışık mikroskobu ile direkt görüntülenebilmekte, değil. exosomes Tipik morfolojik özellikleri, yuvarlak ve 30-100 nm boyutlu membran veziküller. fotoğraflar exosomes CD63 için altın etiketli antikor (ok ile gösterilir) ve non-ile immunohistokimyasal exosomes (B) (A) immunohistokimyasal göstermektedir. Izole veziküller gerçekten exosomes olduğunu belirlemek ve daha exosomal proteinleri karakterize etmek için, Western Blot yaygın olarak kullanılmaktadır. Şekil 4 calnexin, endoplazmik retikulum marker bulunmaması gösterir . Bu veziküller, endoplazmik retikulum az kontaminasyon gösterir. Ayrıca, Şekil 4 exosomes sık zenginleştirilmiş bir tetraspanin exosomes CD81 varlıkları gösterir. Hücresel RNA esas içerenbir Bioanalyzer analizi (Şekil 5A) 18S ve 28S rRNA alt birimden iki önemli zirveleri olarak görülen ribozomal RNA (rRNA). Exosomes iki rRNA zirveleri (18S ve 28S) eksikliği ve kısa RNA, mRNA ve miRNA (Şekil 5B) olarak zenginleştirilmiş Ancak, exosomal RNA, kendi profiline farklı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" /> Şekil 1. Exosomes (30-100 nm) küçük boyutu nedeniyle, flow sitometri ile analiz edildiğinde, arka plan gürültü ve ayırt edilemez. Bu nedenle, daha sonra lazer tarafından görüntülenmiştir olabilir exosomes analiz öncesi antikor kaplı boncuklar, onları takmak için gereklidir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" /> Şekil 2. Kompleks birbirlerine ve form çift ve üçlü boncuk agrega exosome boncuk (A). Gösteren ok tek bir boncuk exo<html> kapılı ve daha fazla analiz için kullanılan bazı nüfus. Bu nüfusun doğrudan exosomes membran moleküllerin varlığını belirlemek için bir izotip kontrolü (dolu gri pik) karşılaştırılır. CD63 pozitif exosomes (siyah açık pik) Şekil B&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" /> Şekil 3. Tipik morfolojisi ve boyutu (40-80 nm) (A ve B) ile exosomes elektron mikroskobu. Resimde ok bu exosome, membran yüzeyinde CD63 olduğunu doğrulayarak, ikincil antikor altın parçacık gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" /> Şekil 4. Western Blot sonuçları endoplazmik retikulum protein calnexin yokluğunda ancak yaygın exosomes, tetraspanin CD81 zenginleştirilmiş protein varlığını gösteren. ve_content &quot;&gt; <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" /> Şekil 5. Bioanalyzer hücreleri (A) ve (B) exosomes varlığı RNA gösteren sonuçlanır. Oklar, 18S gösterir ve 28S rRNA alt birimden hücreleri mevcut. Exosomal RNA erkekçe küçük RNA içeren ya hiç ya da çok az rRNA exosomes tanımlanır.

<ol>
	<li>Pan, B. -. T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro:+Selective+externalization+of+the+receptor.">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li><li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+immune+properties+and+potential+clinical+implementations.">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions.">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li><li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li><li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li><li>Almqvist, N., L&#246;nnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma.">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li><li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction.">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li><li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine:+dendritic+cell-derived+exosomes.">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li><li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA*008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes.">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function.">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li><li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation:+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R&#945;.">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15R&#945;.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li><li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Derived+Microvesicles+Induce,+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+(Treg).">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li><li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8++T-cell+apoptosis.">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li><li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress;+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA.">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li></ol>

JL hücrelere RNA transferi için vektörler olarak exosomes kullanımı ile ilgili bir patent sahibi.

Moleküler içerik ve / veya exosomes fonksiyon öğrenim görürken, bu, uygun bir verim ve mümkün olan en düşük derecede kontaminasyon sağlayan yüksek kaliteli bir yalıtım yöntemi kullanmak için çok önemlidir. Bu yazıda anlatılan metodoloji exosomes yalıtma ve RNA içeriği ve biyolojik işlevini incelemek için iyi kurulmuş bir yaklaşımdır. Ayrıca, elektron mikroskobu, flow sitometri ve Western Blot gibi farklı yöntemler, bir kombinasyonu ile izole exosomes karakterizasyonu önemi vurgulanır. Exosomes izole, ilk santrifüj basamağı (300 xg), hücre süspansiyonu ya da incelenen biyolojik sıvılarda mevcut olabilir pelet hücrelere kullanılır. 16 500 xg ihtiyaçlarına ikinci santrifüj pelet ölü hücreler, daha büyük enkaz, apoptotik organları ve diğer organeller için yeterince güçlü. Bu santrifüj sonra, bazı protokollerde bir nano-filtrasyon adım, ancak bazı investigators bu adımı dışı bırakılmıştır. Ancak, ortadan kaldırılması parçaları ve 200 nm den daha büyük ve bu nedenle güçlü bir filtrasyon adım da dahil olmak üzere tavsiye veziküller önemini vurgulamak. Daha sıkı bir izolasyon gerekli ise, 100 nm filtreler kullanılır, ancak viskoz sıvıların kullanılması durumunda, bu filtreler kolayca bloke olur ve exosomal malzeme kaybolur olabilir ki dikkat edilebilir. Ayrıca, 100 nm filtrasyon exosomes morfolojisi etkileyebilir ve exosomes büyük ölçekli olup olmadığını dahası kaybolabilir. Böylece, 200 nm filtreleri exosome izolasyonu için uygun görünüyor. Süzüldükten sonra, 120.000 xg&#39;de zorunlu Ultrasantrifügasyon exosomes pelet için kullanılır. Exosomes daha fazla antikor kaplı boncuklar bağlı ve yıkanmış veya kirlenme proteinler kaldırmak için sukroz gradient yerleştirilen PBS ile yıkanır. Ancak, bu başlangıç ​​örnek hacmi, özellikle küçük ve / veya RNA içeriği o, biz gerekli olmadığı iddia bir çok kaynak alıcı bir süreç olabilirek adımlar önemli ölçüde daha fazla malzeme azalacak f exosomes düşük olması. Ancak, yine, izole veziküllerin doğası bazı proteinlerin varlığı ve yokluğu ile kanıtlanmış olmalıdır. Bugüne kadar, kesinlikle benzersiz protein exosomes için hiçbir işaretleyici örnek exosomes ve başka bir şey içerdiğini doğrulamak için tespit edilmiştir. Sonuç olarak, yöntemlerin bir kombinasyonu, elektron mikroskobu ile exosomes boyutu ve morfolojisi belirlenmesi de dahil olmak üzere exosomes, karakterize etmek için gereklidir. Ayrıca, bu yöntem, mikro, apoptotik organları ya da hücre artıkları gibi büyük veziküller, örneğin örnek kontaminasyon düzeyinin genel bir bakış sağlamak gibi örnek saflığı, elektron mikroskobu ile tespit edilebilir. Ayrıca, akım sitometri ve Western Blot exosomes protein içeriği belirlenir ve hem membran bir analiz, bu iki yöntemin sonuçları kombinasyonu (örn. CD63 bağlı veExosomes CD81) ve içselleştirilmiş proteinler (örneğin Tsg101 ve Alix). Algılama, CD63, Tsg101 ve Alix, endoplazmik retikulum protein calnexin gibi proteinlerin yokluğu gibi exosomes, zenginleştirilmiş proteinlerin exosome zenginleştirilmiş pelet gerçekten exosomes ve veziküllerin hücrenin diğer bölmeleri kirlenmesine neden olduğunu bir göstergesidir. Exosomes tespit RNA profili sağlam hücreleri bulunan RNA temelde farklı. Böylece, Bioanalyzer veya jel bazlı RNA analiz yaklaşımları analiz exosomal RNA hücresel RNA analizi belirgin 18S ve 28S rRNA alt birimden, iki tepe yoksundur. Bu nedenle bir örnek rRNA önemli bir miktarı tespiti, izolasyon yöntemi geliştirilmiş ve kalite güvence gerektiğini, böylece çıkarılan toplam RNA yalnız exosomal kökenli olduğunu gösterir ve bu savunuyorlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Exosome izolasyon </td></tr><tr><td> Optima L-90K ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Hızlı yapışma ultrasantrifüjdeki tüpler </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Rotorun bağlı olarak kullanılan farklı tüpler ihtiyaç vardır. Ti70 (342.414), Ti45 (345.776) </td></tr><tr><td> Hızlı-Seal Akülü Tüp Topper kiti </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Şırınga Filtresi, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> VWR Uluslararası viskoz akışkanlar ve / veya büyük hacimler, Vakum filtrasyon sistemi, 0.2 mm, (514-0600) yerine kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Elektron mikroskobu </td></tr><tr><td> Formvar / karbon kaplı nikel ızgaralar </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Fare-insan, anti-CD63 </td><td> Bioscience BD </td><td> 556019 </td><td> Final kons: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Izotip kontrolü; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Final kons: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Anti-Mouse IgG Gold Konjugat, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Final kons:% 1 </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega Elektron mikroskobu </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Veya eşdeğeri ekipman. </td></tr><tr><td> Flow sitometri </td></tr><tr><td> 4μm aldehid / sülfat lateks boncuk </td><td> Arayüzey Dynamics </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Lateks boncuk kaplama için Antikor </td><td></td><td></td><td> Örneğin anti-CD63 Bioscience BD (556.019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mikser RM-2L </td><td> Elmi </td><td></td><td> Veya eşdeğeri ekipman. </td></tr><tr><td> Insan serumu ile IgG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Algılama için antikorlar </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> Örneğin: PE anti-CD63 (556.020) PE anti-CD9 (555.372), anti-CD81 PE (555.676) İzotip kontrolü (555.749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Veya eşdeğeri ekipman. </td></tr><tr><td> Exosomal RNA ve RNA analiz izolasyonu </td></tr><tr><td> miRCURY RNA İzolasyon Kiti </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

Exosome araştırma alanında hızla yayınlarda son yıllarda dramatik bir artış ile genişletiyor. Endositik kökenli bu küçük veziküller (30-100 nm) eritrositler 1 içine olgunlaşması retikülositler transferrin reseptör ortadan kaldırmak için bir yol olarak işlev ilk teklif edildiğinde, ve daha sonra exosomes seçildiler. Exosomes multivesicular organları (MVBs) üreten, endosomes geç içe tomurcuklanan tarafından oluşturulan ve plazma zarı 2 ile MVBs füzyonu çevreye salınır. Exosomes ilk keşfinden beri, hücrelerin geniş bir yelpazede bu veziküller serbest bırakmak için ortaya konmuştur. Exosomes de dahil olmak üzere birçok biyolojik sıvılarda, plazma, nazal lavaj sıvısı, tükürük, anne sütü 3-6 tespit edilmiştir. Ayrıca, exosomes içeriği ve işlevi kaynaklanan hücre ve hangi koşullar altında üretilen bağlı olduğunu kanıtlanmıştır. Fonksiyonları çeşitli iblislerallerjen 7,8, farelerde 9, T regülatör hücreleri 13, 14 T hücre çoğalması uyarımı inhibisyonu ve doğal katil hücrelerin aktivasyonu 10-12, farklılaşma tanıtım yerleşmiş tümörlerin ortadan kaldırılmasına karşı tolerans indüksiyonu gibi exosomes ve için hayal kırıklığına uğramışlardı ; 15 apoptozis T hücre indüksiyon. Yıl 2007, mast hücreleri serbest exosomes mesajcı RNA (mRNA) ve microRNA (miRNA) içerirler ve RNA üzerinden başka bir exosomes bir hücre için mekik olduğunu göstermiştir. Alıcı hücreleri, exosomes tarafından mekik mRNA, transfer RNA 16, düzenleyici bir işlev düşündüren, protein tercüme oldu . Ayrıca, biz de alıcı hücreleri oksidatif stres altında yetiştirilen hücreler türetilmiştir exosomes daha fazla strese karşı tolerans neden ve böylece exosomal transfer RNA 17 biyolojik bir işlevi önermek olduğunu göstermiştir . Hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda coveziküller bir karışımı ntain ve parçaları döken. Exosomes için yüksek kaliteli bir izolasyon yöntemi, karakterizasyonu ve exosomes ve içeriklerinin belirlenmesi, bu nedenle diğer veziküller ve parçacıklar exosomes ayırt etmek çok önemlidir. Burada, hücre kültürü, orta ve vücut sıvıları hem exosomes izolasyonu için bir yöntem sunar. Bu izolasyon yöntemi exosomes pelet olan nihai bir Ultrasantrifügasyon adım takip tekrarlanan santrifüj ve filtrasyon adımları dayanmaktadır. Exosomes exosomal morfolojisi ve protein içeriği belirlemek ve karakterize etmek için önemli yöntemler de dahil olmak üzere, elektron mikroskobu, flow sitometri ve Western Blot vurgulanır. Toplam exosomal RNA arıtma spin kolon kromatografisi dayalı ve exosomal RNA verim ve boyut dağılımı Bioanalyzer kullanılarak analiz edilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Bu kağıt, izolasyon, saflaştırma ve exosomes tespiti, moleküler içerik analizi teknikleri gibi yöntemleri gösteriyor. Bu yöntemler, hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda exosome izolasyonu için uyarlanabilir ve moleküler içerik analizi ötesinde işlevsel çalışmalarda da yararlı olabilir.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...