Name: preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device at JoVE.com

<p class="jove_title"> Compartmentalization에 대한 E18 태아 쥐 두피 뉴런 준비 </p><p class="jove_content"> 밖으로 시작하기 전에, 그것은 37 ° C.에 필요한 모든 미디어 및 시약을 따뜻하게하는 것이 중요합니다 </p><p class="jove_content"> 70 % 에탄올로 닦고으로 후드에 배치하는 세포 (예, 고무 전구, 튜브 랙, 미디어 병 등), 그 준비에 사용되는 모든 소독하는 것도 중요하다. </p><ol><li> 1 ML 얼음처럼 차가운 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼를 포함하는 15 ML 튜브에 넣어 E18 태아 쥐의 피질의 두 가지 (한 두뇌 이전 해부)를. </li><li> 2 ML 및 0.125 %로 최종 트립신 농도에 최종 볼륨을 가져, 해부 버퍼에있는 피질로 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML을 추가합니다. </li><li> 팔분에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 15 ML 튜브를 놓습니다. </li><li> 이 기간 동안, 화재 폴란드어 3 유리 파스퇴르 pipets은 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 연속 작은 구멍을 형성. </li><li> 피질의 8 분 부화 후 DMEM는 트립신 반응을 멈출 수 있도록 도와줘 피질 10 % FBS를 포함한 10 ML를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 2,500 rpm으로 피질과 DMEM/10 % FBS를 포함한 15 ML 튜브를 원심 분리기. </li><li> biosafety 캐비닛에서 진공 흡입 붙어있는 유리 파스퇴르 pipet을 사용하여 피질에서 뜨는을 제거하십시오. 방해 또는 펠렛을 이동시키다하지 않도록주의하십시오. </li><li> 피질 펠렛 부드럽게 pipet 위아래로 NMB 1 ML을 추가합니다. 이것은 공기 거품이 산화하여 세포를 손상시킬 수 있으므로, 아래 pipeting 및하면서 공기 방울을 만드는 피하기 위해 매우 중요합니다. </li><li> 끝까지 멸균 고무 벌브를 장착하고 5 번하고 아래로 pipeting하여 피질을 씹다 수있는 넓은 개방과 함께 불을 광택 파스퇴르 pipet을 사용하여 다시 신중하면 공기 방울을 소개하지 않습니다. 감소 오프닝 크기 각각 다른 두 유리 pipets이 과정을 계속합니다. </li><li> 분쇄 후 2 분 동안 2,500 rpm으로 다시 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 다시 뜨는을 제거하고 NBM 2 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 45 음 셀 스트레이너를 통해 resuspended 세포 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 계산하고, 장치에 로드된 Trypan 블루와 세포를 얼룩. 우리는 일반적으로 장치마다 세포의 20 UL을로드합니다. </li></ol><p class="jove_content"> <em>참고</em> : 세포의 최종 농도는 일반적으로 2,500,000 세포 / ML 및 8,000,000 세포 / ML 사이 </p><p class="jove_title"> 세포를 로딩 </p><p class="jove_content"> 세포가 계산되고 나면, 그것은 장치에있는 세포를 로드할 시간 : </p><ol><li> 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 NBM를 포함하는 이전에 준비 장치를 가져와. </li><li> 진공 흡입하여 우물에서 여분의 미디어를 제거합니다. 그러나 미디어를 모두 제거하지 않도록주의 - 메인 채널의 일부 언론이 있어야합니다. </li><li> (그림 필요한 경우 참조) 장치의 상단 왼쪽 저수지로 세포의 20 UL을 적용합니다. 세포의 장치에 흐름과 PLL 처리 표면에 첨부합니다. </li><li> 로딩 후, 세포 부착 수 있도록 10 분 동안 인큐베이터에 다시 세포를 포함하는 장치를 놓으십시오. </li><li> 십분 후에 다시 인큐베이터 미디어과 장소 장비와 저수지를 입력합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>1</b>, 2128-2136 (2006).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Methods</em>. <b>2</b>, 599-605 (2005).</li></ol>

<p> 세포 밀도가 응용 프로그램에 따라 다양한하실 수 있습니다. 그러나 밀도가 너무 낮아에서 기본 뉴런을 심는 것은 일반적으로 세포 사망에 이르게한다. 인큐베이터와 습도의 수준에 따라, 미디어 장치마다 2~3일 변화해야 할 수 있습니다. 미디어를 변경하면, 그것은 주요 채널에서 미디어를 제거하지 않는다는, 저수지에서 미디어를 제거한 후에 중요합니다. 더 나아가, 그것은 최고 우물에 신선한 미디어를 장소와 신선한 미디어의 모든 저수지를 작성하기 전에 장치를 통해 주요 채널로 흘러 수 있도록하는 것이 좋습니다. </p>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NBM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>E18 rat embryos</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats.  The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.</td>
</tr>
<tr>
<td>CMFM dissection buffer HBSS</td>
<td>buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352097</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C</td>
</tr>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&#x02DA;C water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>serum, used at 10% in DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>set at 2500 rpm </td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for counting live/dead cells</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon Cell Strainer 40 um</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon cat# 352340</td>
<td>Available through Fisher Scientific.  Fisher catalog# 08-771-1</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device

<p class="jove_content"> 이 비디오에서는, 우리는 대뇌 피질 E18 쥐 뉴런의 준비를 보여줍니다. E18 피질 쥐의 뉴런는 이전에 다음 ID로 해부하고 준비 E18 태아 쥐의 대뇌 피질에서 얻을 수 있습니다. E18의 피질 개별 뉴런에 즉시 dissociated, 절개시입니다. 그것은 해리가 수행되기 전에 최대 일주일까지 4 B27를 포함하는 최대 절전 E 버퍼 ° C에서 E18 피질을 저장할 수 있습니다. 그러나, 세포 생존에 드롭있을 것입니다. 일반적으로 우리 E18 접속 신선한를 구하십시오. 그것은 차가운 얼음 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼 (CMFM)에있는 실험실로 이송됩니다. 도착하자마자, 트립신은 0.125 %의 최종 농도 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 팔분에 대해 37 ° C에서 incubated입니다. 10% FBS를 포함한 DMEM는 반응을 막기 위해 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 제거하고 신경 기저 미디어 2 ML (NBM)는 2퍼센트 B27 (권 / 권)와 Glutamax (권 / 권)이 다음과 위아래로 pipetting하여 다시 중단되는 피질에 추가됩니다 0.25 %를 포함합니다. 다음 피질은 연속된 작은 오프닝과 함께 이전에 화재 광택 유리 pipettes, 각 triturated 있습니다. triturating 후, 피질은 다시 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 그런 다음 제거 피질 펠렛은 B27와 Glutamax을 포함 NBM 2 ML로 다시 일시 중지되었습니다. 세포 현탁액은 다음 40 음 나일론 셀 스트레이너를 통해 전달됩니다. 다음 세포가 계산됩니다. 뉴런은 이제 신경 microfluidic 장치에 로딩을위한 준비가되어 있습니다. </p>

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Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

<p class="jove_content">이 비디오에서는 E18 두피 랫 뉴런의 준비를 보여줍니다.</p>

Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

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