Name: preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device at JoVE.com

<p class="jove_title"> Подготовка E18 плода крысы корковых нейронов для фрагментации </p><p class="jove_content"> Прежде чем начать, важно, чтобы согреть все необходимые средства массовой информации и реагенты до 37 ° C. </p><p class="jove_content"> Важно также, чтобы стерилизовать все, что используется для приготовления клеток (например, резиновые луковицы, трубки стеллажи, средств массовой информации бутылки и т.д.), и то, что помещается в капот, путем протирания вниз с 70% этанола. </p><ol><li> Положите два куска E18 плода Cortex Крыса (один мозг, ранее расчлененных) в 15 мл пробирку, содержащую 1 мл ледяной кальция без магния без буфера рассечение. </li><li> Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-EDTA в кору головного мозга в рассечение буфера, в результате чего конечный объем до 2 мл и конечной концентрации трипсина до 0,125%. </li><li> Место 15 мл трубки в 37 ° С водяной бане в течение 8 минут. </li><li> За это время огонь польский 3 стакана Пастера пипец, образуя последовательно меньшие отверстия, в кабинете биологической безопасности, чтобы помочь сохранить стерильность. </li><li> После 8 минут инкубации коры, добавьте 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS в кору головного мозга, чтобы помочь остановить трипсина реакции. </li><li> Центрифуга 15 мл пробирку коры и DMEM/10% ЭТС при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут. </li><li> В кабинете биобезопасности, удалить супернатант из коры использованием пипетки Пастера стекла с вакуумной всасывания прилагается. Будьте осторожны, чтобы не нарушить или выбить гранул. </li><li> Добавить 1 мл NMB в кору головного мозга гранул и осторожно пипеткой вверх и вниз. Это очень важно, чтобы избежать создания пузырьков воздуха в то время как pipeting вверх и вниз, как пузырьки воздуха могут повредить клетки в результате окисления. </li><li> Используйте огневой полировкой пипетки Пастера с самой широкой открытости измельченного в порошок коры путем присоединения стерильные резиновые лампы до конца и pipeting вверх и вниз 5 раз, опять же будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха. Продолжайте этот процесс с другими 2 пипец стекла, каждый из которых снизилась открытия размера. </li><li> После растирания, центрифуги вниз клетки снова при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут. </li><li> После центрифугирования, еще раз удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл НБМ. </li><li> Фильтры ресуспендировали решение клетки через 45 мкм фильтр клетки. </li><li> Пятно клеток с Трипановый Синий, посчитали, и загружаются в устройства. Как правило, мы нагрузка 20 мкл клеток на устройстве. </li></ol><p class="jove_content"> <em>Примечание:</em> Конечная концентрация клеток, как правило, от 2,5 млн. кл / мл и 8 миллионов клеток / мл </p><p class="jove_title"> Загрузка клетки </p><p class="jove_content"> После клетки были пересчитаны, пришло время для загрузки клеток в устройстве: </p><ol><li> Принесите заранее подготовленные устройств, содержащих НБМ в кабинет биобезопасности для поддержания стерильности. </li><li> Удалите излишки средств массовой информации из скважин путем вакуумного всасывания. Однако, будьте осторожны, чтобы избежать удаления всех средств массовой информации - должны быть некоторые средства массовой информации в основном канале. </li><li> Применяют 20 мкл клеток в левый верхний резервуар руку устройства (см. схему при необходимости). Клетки впадают в устройство и подключить к PLL обрабатываемой поверхности. </li><li> После загрузки, места устройства, содержащие клетки обратно в инкубаторе в течение 10 минут, чтобы дать клеткам прикрепить. </li><li> Через 10 минут заполнить резервуары со средствами массовой информации и разместить устройств еще в инкубаторе. </li></ol>

<ol>
	<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>1</b>, 2128-2136 (2006).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Methods</em>. <b>2</b>, 599-605 (2005).</li></ol>

<p> Сотовые плотность может меняться в зависимости от приложения. Однако, посев первичных нейронов при слишком низкой плотности обычно приводит к гибели клеток. В зависимости от инкубатора и уровень влажности, средства массовой информации, возможно, должны быть изменены в устройства каждые 2 до 3 дней. При смене медиа, важно после удаления информации из водохранилищ, чтобы никогда не извлекайте носитель из основных каналов. Кроме того, она является хорошей практикой является размещение свежей информации в верхней скважин и позволяет свежим СМИ течь через устройство и на основных каналах до заполнения всех водоемах. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NBM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>E18 rat embryos</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats.  The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.</td>
</tr>
<tr>
<td>CMFM dissection buffer HBSS</td>
<td>buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352097</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C</td>
</tr>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&#x02DA;C water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>serum, used at 10% in DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>set at 2500 rpm </td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for counting live/dead cells</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon Cell Strainer 40 um</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon cat# 352340</td>
<td>Available through Fisher Scientific.  Fisher catalog# 08-771-1</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device

<p class="jove_content"> В этом видео, мы демонстрируем подготовки E18 корковых нейронов крысы. E18 корковых нейронов крысы получают из коры плода E18 крысы ранее расчлененных и подготовлены. Коры E18 есть на рассечение, сразу же распадается на отдельные нейроны. Можно хранить E18 коры в Hibernate E буфер, содержащий B27 при 4 ° С не более недели, прежде чем диссоциация не выполняется. Тем не менее, будет падение жизнеспособности клеток. Обычно мы получим нашу E18 Cortex свежим. Они транспортируются в лабораторию в ледяной Кальций Магний свободный свободный буфер рассечение (CMFM). Прибыв на место, трипсина добавляется в коре до конечной концентрации 0,125%. Коры затем инкубировали при 37 ° С в течение 8 минут. DMEM, содержащей 10% FBS добавляется в коре, чтобы остановить реакцию. Коры затем центрифугировали при 2500 оборотах в минуту в течение 2 минут. Супернатант удаляют и 2 мл нейронных Базальные Media (НБМ), содержащий 2% B27 (об / об) и 0,25% Glutamax (об / об) добавляется к коре, которая затем повторно приостановлено пипетирования вверх и вниз. Далее, коры растирают с ранее огнем полированные стеклянные пипетки, каждый из которых последовательно меньшие отверстия. После растирания, коры вновь центрифугировали при 2500 оборотах в минуту в течение 2 минут. Супернатант затем удаляется и коры гранулы ресуспендировали с 2 мл НБМ содержащие B27 и Glutamax. Клеточной суспензии затем проходит через сетчатый фильтр 40 мкм ячейка нейлона. Следующая ячейки учитываются. Нейронов теперь готовы для загрузки в устройство нейрона микрожидкостных. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device at JoVE.com

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

<p class="jove_content">В этом видео мы демонстрируем подготовки E18 корковых нейронов крысы.</p>

Подготовка E18 корковых нейронов крысы за раздробленности в микрожидкостных устройств

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Research

JoVE Journal

Biology

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Органотипической культуре Кусочек E18 Мозги крысы

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Изготовление микрожидкостных Устройство для дробления Нейрон Сома и Аксоны

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Микрожидкостных устройств с Groove Шаблоны для изучения Сотовая Поведение

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

Градиент генерирующих микрожидкостных Устройство для клеточной биологии

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-лимфоцитов Захват Использование одноразовых микрофлюидный чип на ВИЧ

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Сотовые Захват Использование микрожидкостных устройств

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Оценка подвижности нейронных стволовых клеток Использование агарозном геле основе микрожидкостных устройств

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Протокол для культивирования симпатических нейронов крысы из верхних шейных ганглиев (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Использование Rotorod как метод Качественный анализ Прогулка по Крыса

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...