Name: preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device at JoVE.com

<p class="jove_title"> Förbereda E18 Fostrets Råtta kortikala nervceller för fack </p><p class="jove_content"> Innan du börjar är det viktigt att värma upp alla nödvändiga medier och reagenser till 37 ° C. </p><p class="jove_content"> Det är också viktigt att sterilisera allt som används för att förbereda celler (t.ex. gummi glödlampor, rör rack, media flaskor, etc.), och det som är placerad i huven, genom att torka ner med 70% etanol. </p><ol><li> Placera två bitar av E18 Fostrets Råtta Cortex (en hjärna, som tidigare dissekerat) i ett 15 ml rör som innehåller 1 ml iskall kalciumfri Magnesium-fria dissektion buffert. </li><li> Tillsätt 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA till cortex i dissektionen buffert, vilket innebär att den slutliga volymen till 2 ml och slutlig Trypsin koncentration till 0,125%. </li><li> Placera 15 ml röret i 37 ° C vattenbad i 8 minuter. </li><li> Under denna tid, brand polera 3 glas Pasteur pipetter och bildar successivt mindre öppningar i en biosäkerhet skåp för att bibehålla sterilitet. </li><li> Efter 8 minuters inkubation av hjärnbarken, tillsätt 10 ml DMEM innehåller 10% FBS till cortex för att hjälpa till att stoppa trypsin reaktionen. </li><li> Centrifugera 15 ml röret med cortex och DMEM/10% FBS vid 2500 rpm i 2 minuter. </li><li> I biosäkerhet skåpet, avlägsna supernatanten från cortex med hjälp av ett glas Pasteurpipett med vakuum bifogas. Var noga med att inte störa eller rubba pelleten. </li><li> Tillsätt 1 ml av NMB till cortex pellets och försiktigt pipettera upp och ner. Det är mycket viktigt att undvika att skapa luftbubblor medan pipeting upp och ner, eftersom luftbubblor kan skada celler genom oxidation. </li><li> Använd brand-polerade Pasteurpipett med det bredaste öppningen till mal sönder hjärnbarken genom att fästa en steril gummi glödlampa till slutet och pipeting upp och ner 5 gånger, återigen försiktigt så att inte introducera luftbubblor. Fortsätt denna process med de andra två glas pipetter, vardera med en minskad öppning storlek. </li><li> Efter trituration, centrifugera ner cellerna igen vid 2500 rpm i 2 minuter. </li><li> Efter centrifugering, återigen bort supernatanten och resuspendera cellpelleten i 2 ml NBM. </li><li> Filtrera återsuspenderade cellen lösningen genom ett 45 um cell sil. </li><li> Färga cellerna med Trypan Blå, räknad och laddas i enheterna. Vi lastar typiskt 20 ul av celler per enhet. </li></ol><p class="jove_content"> <em>Obs:</em> Den slutliga koncentrationen av celler är vanligtvis mellan 2,5 miljoner celler / ml och 8 miljoner celler / ml </p><p class="jove_title"> Fylla cellerna </p><p class="jove_content"> När cellerna har räknats är det dags att ladda cellerna i enheten: </p><ol><li> Ta den tidigare beredda produkter som innehåller NBM i biosäkerhet skåpet för att bibehålla sterilitet. </li><li> Ta bort överflödigt material från brunnarna med vakuum. Men var noga med att undvika att ta bort allt material - det måste finnas någon media i huvudkanalen. </li><li> Applicera 20 ul av celler till övre vänstra reservoar av enheten (se diagram om det behövs). Cellerna flöda in i enheten och fäster vid PLL behandlade ytan. </li><li> Efter lastning, placera apparater som innehåller cellerna tillbaka i en inkubator för 10 minuter så att cellerna att fästa. </li><li> Efter 10 minuter, fylla reservoarerna med medier och enheter placera tillbaka i inkubatorn. </li></ol>

<ol>
	<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>1</b>, 2128-2136 (2006).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Methods</em>. <b>2</b>, 599-605 (2005).</li></ol>

<p> Cell täthet kan varieras beroende på tillämpning. Men sådd primära nervceller vid för låg med en densitet av typiskt leder till celldöd. Beroende på inkubatorn och luftfuktighet, kan media behöva ändras i enheter var 2 till 3 dagar. När du byter media är det viktigt när du har tagit materialet från reservoarer, att aldrig ta bort material från de största kanalerna. Vidare är det bra att placera nya medier i topp brunnar och tillåter lite frisk media att flödet genom enheten och i de viktigaste kanalerna innan du fyller upp alla reservoarer. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NBM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>E18 rat embryos</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats.  The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.</td>
</tr>
<tr>
<td>CMFM dissection buffer HBSS</td>
<td>buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352097</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C</td>
</tr>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&#x02DA;C water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>serum, used at 10% in DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>set at 2500 rpm </td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for counting live/dead cells</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon Cell Strainer 40 um</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon cat# 352340</td>
<td>Available through Fisher Scientific.  Fisher catalog# 08-771-1</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device

<p class="jove_content"> I denna video visar vi utarbetandet av E18 hjärnbarken råtta nervceller. E18 kortikala råtta neuron erhålls från E18 fostrets råtta cortex tidigare dissekeras och förberedd. E18 cortex är på dissektion, omedelbart skiljas i enskilda nervceller. Det är möjligt att lagra E18 hjärnbarken i Hibernate E buffert innehållande B27 vid 4 ° C i upp till en vecka innan dissociation utförs. Däremot kommer det att finnas en droppe i cellernas livskraft. Vanligtvis får vi vår E18 Cortex färsk. Det transporteras till labbet i iskallt Kalcium gratis Magnesium gratis dissektion buffert (CMFM). Vid ankomsten är Trypsin läggs till hjärnbarken till en slutlig koncentration av 0,125%. Cortex är sedan inkuberas vid 37 ° C i 8 minuter. DMEM innehållande 10% FBS läggs till hjärnbarken för att stoppa reaktionen. Cortex är sedan centrifugeras vid 2500 rpm i 2 minuter. Supernatanten tas bort och 2 ml av Neural Basal Media (NBM) innehållande 2% B27 (vol / vol) och 0,25% Glutamax (vol / vol) läggs till hjärnbarken som sedan resuspenderas genom att pipettera upp och ned. Därefter är cortex grov-med tidigare brand polerat glas pipetter, alla med en successiv mindre öppning. Efter finfördelande är cortex återigen centrifugeras vid 2500 rpm i 2 minuter. Supernatanten tas sedan bort och hjärnbarken pellets resuspenderas med 2 ml NBM innehåller B27 och Glutamax. Cellsuspensionen leds sedan genom ett 40 um nylon cell sil. Nästa cellerna räknas. Nervceller är nu redo för påfyllning av neuron mikroflödessystem enhet. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device at JoVE.com

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

<p class="jove_content">I denna video visar vi utarbetandet av E18 kortikala Rat nervceller.</p>

Förbereda E18 kortikala Råtta Nervceller för uppdelning i en mikroflödessystem enhet

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Research

JoVE Journal

Biology

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic Slice Kultur av E18 råttors hjärnor

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Tillverkning av en mikroflödessystem enhet för uppdelning av Neuron Soma och Axoner

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

En mikroflödessystem enhet med Groove Mönster till Studera Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

En gradient som genererar mikroflödessystem enhet för cellbiologi

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-lymfocyter ta med en engångs Mikroflödessystem Chip för HIV

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cell ta med en mikroflödessystem enhet

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Förbereda T Factor Cell Tillväxt från Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Bedöma Neurala Motility Stem Cell Använda en agarosgel-baserade mikroflödessystem enhet

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Protokoll för odling sympatiska nervceller från Rat Superior Cervikal Ganglia (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Användning av Rotorod som en metod för kvalitativ analys av Walking i Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...