Name: preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device at JoVE.com

<p class="jove_title"> Compartmentalization E18 Fetal Sıçan Kortikal nöronlar hazırlanması </p><p class="jove_content"> Başlamadan önce, gerekli tüm medya ve reaktifler 37 ° C&#39;ye kadar ısıtmak için önemlidir. </p><p class="jove_content"> % 70 etanol ile silerek, kaput yerleştirilir hücreleri (örneğin, kauçuk ampuller, boru rafları, medya şişeleri, vb), ve hazırlanması için kullanılan her şeyi sterilize etmek için de önemlidir. </p><ol><li> E18 Fetal Sıçan Korteks iki adet (biri beyin, daha önce disseke) 1 ml buz Kalsiyum Magnezyum ücretsiz diseksiyonu tampon içeren 15 ml tüp yerleştirin. </li><li> Son hacmi 2 ml ve% 0.125 &#39;son tripsin konsantrasyon getirerek, diseksiyon tamponunda kortekse 1 ml% 0.25&#39; lik tripsin-EDTA ekleyin. </li><li> 8 dakika 37 ° C su banyosunda 15 ml tüp yerleştirin. </li><li> Bu süre zarfında, yangın cilası 3 su bardağı Pasteur pipetler, kısırlık korumaya yardımcı olmak için bir biyogüvenlik kabini, gittikçe daha küçük açıklıklar oluşturan. </li><li> Korteksin 8 dakika inkübasyondan sonra, DMEM korteks tripsin reaksiyon durdurmaya yardımcı olmak için% 10 FBS içeren 10 ml ekleyin. </li><li> 2 dakika süreyle 2500 rpm&#39;de korteks ve DMEM/10% FBS içeren 15 ml tüp santrifüjleyin. </li><li> Biyogüvenlik kabini, vakum emme eklenmiş bir bardak yeniden süspanse kullanarak korteks süpernatant kaldırmak. Rahatsız ya da pelet çıkarmak için dikkatli olun. </li><li> NMB 1 ml korteks pelet ve hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı ekleyin. Bu hava kabarcıkları oksidasyonu ile hücrelere zarar verebilir gibi, aşağı yukarı pipeting sırasında hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için çok önemlidir. </li><li> Sonuna kadar steril bir kauçuk ampul takmak ve 5 kat yukarı ve aşağı pipeting korteks çiğnemek geniş açılması ile yangın cilalı yeniden süspanse kullanın, yine dikkatli olmak hava kabarcıkları tanıtmak değil. Her bir azalma açılış boyutu ile, diğer 2 cam pipetler ile bu işleme devam edin. </li><li> Öğütme sonra 2 dakika süreyle 2500 rpm&#39;de hücreleri tekrar santrifüj. </li><li> Santrifüj sonra, bir kez daha süpernatantı kaldırmak ve NBM 2 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 45 um hücre süzgecinden yeniden süspanse hücre çözümü Filtresi. </li><li> Sayılır ve cihazlar içine yüklenen Tripan Mavi, hücrelerin Leke. Biz genellikle cihaz başına 20 ul hücrelerinin yükleyin. </li></ol><p class="jove_content"> <em>Not:</em> hücrelerin nihai konsantrasyonu tipik olarak 2,5 milyon hücre / ml ve 8 milyon hücre / ml arasında </p><p class="jove_title"> Hücrelerin yükleniyor </p><p class="jove_content"> Hücreler sayılır edildikten sonra, cihaz hücreleri yük zamanı: </p><ol><li> Kısırlık korumak için biyogüvenlik kabini içine NBM içeren önceden hazırlanmış cihazlar getirin. </li><li> Vakum emiş kuyularından aşırı ortamı çıkarın. Ancak, tüm medya kaldırarak önlemek için dikkatli olmak, ana kanal bazı medya olması gerekir. </li><li> (Diyagram gerekirse bakınız) hücrelerin 20 ul cihazın sol üst rezervuar uygulayın. Hücreleri cihazın içine akışı ve PLL tedavi yüzey eklemek. </li><li> Yükledikten sonra, bir kuluçka hücreleri takmak için izin vermek için 10 dakika geri hücreleri içeren cihazlar yerleştirmek. </li><li> 10 dakika sonra geri inkübatör medya ve yer cihazlar rezervuarları doldurun. </li></ol>

<ol>
	<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>1</b>, 2128-2136 (2006).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Methods</em>. <b>2</b>, 599-605 (2005).</li></ol>

<p> Hücre yoğunlukları uygulamaya bağlı olarak çeşitli olabilir. Ancak, çok düşük bir yoğunluğu birinci nöron ekim genellikle hücre ölümüne yol açar. Inkübatör ve nem düzeyine bağlı olarak, medya cihazları her 2-3 günde değişti gerekebilir. Ortamı değiştirirken, ana kanal medya kaldırmak asla rezervuarları medya çıkardıktan sonra önemlidir. Bunun yanı sıra, taze medya üst kuyular yerleştirin ve tüm rezervuarlar doldurmadan önce cihaz üzerinden ve ana kanal içine biraz taze medya akışını sağlamak için iyi bir uygulamadır. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NBM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>E18 rat embryos</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats.  The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.</td>
</tr>
<tr>
<td>CMFM dissection buffer HBSS</td>
<td>buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352097</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C</td>
</tr>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&#x02DA;C water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>serum, used at 10% in DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>set at 2500 rpm </td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for counting live/dead cells</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon Cell Strainer 40 um</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon cat# 352340</td>
<td>Available through Fisher Scientific.  Fisher catalog# 08-771-1</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device

<p class="jove_content"> Bu video, E18 kortikal sıçan nöronların hazırlık göstermektedir. E18 kortikal sıçan nöronlar önceden disseke ve hazırlanan E18 fetal sıçan korteks elde edilir. E18 korteks bireysel nöronlar içine hemen ayrışmış, diseksiyon üzerine. Bu ayrışma yapmadan önce bir hafta için 4 B27 içeren Hazırda Bekleme E tampon ° C korteks E18 saklamak mümkündür. Ancak, hücre canlılığı bir düşüş olacaktır. Genelde bizim E18 Cortex taze edinin. Bu buz Kalsiyum Magnezyum ücretsiz diseksiyonu tamponu (CMFM) laboratuarına sevk edilir. Varışta, tripsin,% 0.125 final konsantrasyonu korteks eklenir. Korteks, 8 dakika sonra 37 ° C&#39;de inkübe edilir. % 10 FBS içeren DMEM reaksiyonu durdurmak için korteks eklenir. Korteks daha sonra 2 dakika süreyle 2500 rpm&#39;de santrifüj edilir. Süpernatant kaldırılır ve Sinir Bazal Medya 2 ml (NBM)% 2 B27 (hacim / hacim) ve% 0.25 &#39;Glutamax (hacim / hacim), sonra yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yeniden askıya kortekse eklenir içeren. Ardından, korteks ardışık küçük açılması ile daha önce yangın parlatılmış cam pipetler, her triturated. Triturating sonra, korteks yine 2 dakika boyunca 2500 rpm&#39;de santrifüj edilir. Süpernatant sonra kaldırılır ve korteks pelet B27 ve Glutamax içeren NBM 2 ml ile tekrar askıya. Hücre süspansiyonu daha sonra 40 um naylon hücre süzgecinden geçirilir. Sonraki hücreler sayılır. Nöronlar, nöron mikroakışkan cihaza yüklenmesi için artık hazır. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device at JoVE.com

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

<p class="jove_content">Bu video E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlık göstermektedir.</p>

Mikroakışkan Aygıt compartmentalization E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlanması

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Research

JoVE Journal

Biology

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Rat splenositlerin T Hücre Büyüme Faktörü hazırlanması

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Rotorod Rat Yürüyüş Kalitatif Analiz için bir yöntem olarak kullanımı

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...