Name: ex vivo imaging of t cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes at JoVE.com

저자는 우리가 림프 노드 조각을 수행하는 것이 좋습니다 박사 알랭 Trautmann 감사하고 싶습니다. 이 작품은 리그 Nationale Contre 르 암, Fondation 부어 라 레쳐치 Médicale 엉 프랑스와 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 림프절에서 준비 조각 <ol><li> 삽입을위한 4% 낮은 용융 점 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. PBS 및 마이크 로파이 솔루션의 아가로 오스를 희석. 아가로 오스가 완전히 해소되면 ° C까지 사용을위한 준비 37 솔루션을 유지합니다. </li><li> 6 잘 조직 문화 플레이트를 준비합니다. 물론 당 1.1 ML RPMI 전체 문화 매체를 추가하고 각 우물에 organotypic 필터를 삽입합니다. 4 6 - 그럼 플레이트 플레이스 ° C 조각을 전송할 준비까지. </li><li> RPMI 완벽한 매체로 가득 플라스틱 그릇에 4 mm의 내부 직경과 함께 스테인리스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔는 더욱 vibratome 컷 슬라이스에있는 세포를 집중하는 데 사용됩니다. </li><li> 현지 동물 복지 규정에 따라 마우스를 희생. 조심스럽게 주위 조직에서 주변 림프절을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 플라스틱 접시에 놓으십시오. 이들 장기는 매우 부드럽고로 치료는 림프 노드 구조를 손상하지 않도록해야합니다. </li><li> 35 mm 플라스틱 그릇에 4 % 아가로 오스 겔 -를 붓고하고 정교한 젤로 노드를 전송합니다. 하든 5 분 얼음 아가로 오스 겔를 남겨주세요. </li><li> 접시에서 블록을 제거하고 각 림프절 주위 젤의 3~5mm를 떠나하기 위해 한천을 잘라. </li><li> 무독성 조직 접착제와 vibratome의 표본 디스크에 포함된 노드를 연결합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 가득한 사진첩의 표본 디스크를 설치합니다. </li><li> 섹션 한천 - 임베디드 중간 범위 (1.5 ㎜)에 설정된 속도 범위에 설정된 vibratome 속도 (0.3 mm / s)로하고 진동 주파수와 320 μm의 두께로 조직을. </li><li> 그들이 좋은 집게를 사용하여 organotypic 문화 삽입에 절단되는 등 신중하게 림프절의 조각 전송할 수 있습니다. 각 삽입 3 조각 플레이스. 조각이 쉽게 손상될 수있는 큰주의를 기울이시기 바랍니다. 320 μm의에서자를 때 전형적인 주변 림프절은 5 섹션을 얻을 것입니다. 그들은 단지 피상적인 조직을 포함하는 등, 처음이자 마지막 조각 폐기하십시오. </li><li> 각 슬라이스에 스테인레스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔가 잘 조직을 둘러싸고있는 아가로 오스에 위치하고 있는지 확인하십시오. </li><li> 37 문화 판을 품어 ° 5 % CO 2 배양기에서 C humidified 플레이트 T 세포 준비까지. </li></ol> 2. 마우스 림프절에서 T 세포를 분리 <ol><li> 이전에 게시된 조브의 제 3에 따라 T 세포를 분리. </li><li> 바로 T 세포를 사용하여 다음 섹션을 참조하십시오. 그렇지 않으면, lymphocytes 10 NG / ML IL - 7과 함께 보충 RPMI - 미디어 전체에 야간 교양 수 있습니다. </li></ol> 3. 절연 T 세포의 라벨링 <ol><li> HBSS에 세포를 씻으십시오. ML 당 10 × 10 6 동일한 버퍼에서 그들을 Resuspend. </li><li> 0.5 μm의의 최종 농도를주는 1 μm의 세포 커 녹색 CMFDA이 포함된 HBSS 같은 볼륨을 추가합니다. </li><li> ° C 5 분 동안 37 세포 현탁액을 품어. RPMI - 중간 완료와 함께 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> RPMI - 매체 전체에서 ML 당 10 × 10 6 최종 농도에서 세포 Resuspend. 이러한 레이블 세포 조각에 도금 것입니다. </li></ol> CMFDA 이외 형광 염료도 사용하지만, 이러한 분자가 특정 농도 이상의 잠재적인 독성이있다 명심 수 있습니다. 4. 림프절의 조각에 도금 분류 T 세포 <ol><li> 피펫으로 세탁기의 내부 부분에 포함된 초과하는 매체를 제거합니다. 조직이 건조되는 것을 허용하지 않습니다,이 단계에서 신속하게 작동합니다. </li><li> 부드럽게 세탁기의 내부 부분을 1로 2 X 10 5 세포에 해당하는 10-20 μl 표시 T 세포를 분배. 케어는 피펫의 끝에있는 조직을 접촉하지 않도록해야합니다. 세포 현탁액의 드롭이 자리에 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> 37 인큐베이터에있는 세포와 조각 플레이스 ° C와 5% lymphocytes는 조직으로 마이 그 레이션 수 있도록 최소 30 분 CO 2. </li></ol> 5. 림프절의 슬라이스 내에 이미징 T 세포 이 비디오 문서에서는, 우리는 위드 거꾸로 현미경과 공촛점 직립 현미경으로 림프절 슬라이스의 이미지 형광 T 세포. <ol><li> 37 온도를 설정 ° C. 우리의 현미경은 온도 제어 챔버를 갖추고 있습니다. </li><li> 산소 (5 % CO 2 95 % O 2) 페놀 레드 무료 RPMI 매체와 림프절 슬라이스의 지속적인 재관류를 지원 재관류 체제를 설치하십시오. Google 시스템에서, perfused 미디어는 중력에 의해 한쪽에서 이미징 챔버에 들어갑니다. 매체는 폐기물 수집 플라스크에 연결된 펌프 aspirated입니다. 미디어 유량 1 ML / 분으로 설정합니다. </li><li> 고급 집게로 정교한 6 잘 판에서 슬라이스를 가지고 조직에 침투하지 형광 세포를 제거하는 몇 초 동안 예열 산소 RPMI 매체의 준비를 찍어. </li></ol> IMA넓은 필드가 바뀌 현미경으로 T 세포를 ging <ol start="4"><li> 유리 바닥 요리의 내부 부분에 접착 나일론 스레드로 구성된 사용자 정의 만든 영상 챔버에 거꾸로 슬라이스를 놓습니다. 이 챔버에서 나일론 스레드는 유리에서 슬라이스를 제고하고 조직으로 확산하는 산소 솔루션을 가능하게합니다. 림프절의 T 세포의 마이 그 레이션 산소에 강하게 의존이므로이 필요합니다. 그 위에 스테인리스 스틸 와셔를 추가하여 슬라이스를 확보. 이러한 조건에서 슬라이스는 재관류 솔루션의 갱신을 용이하게 요리의 바닥 위에 몇 미크론을 자리잡고 있습니다. </li><li> 보기의 넓은 분야 (800 × 800 μm의, 노드의 슬라이스 표면의 약 3 분의 1을) 캡처하려면, 10X 건조 목적 렌즈를 사용하여 이미지를 수집합니다. 우리는 10X 니콘 S 플루어 0.5 NA 우리 분석에 가장 적합한 것으로 나타났습니다. </li></ol> 전형적인 시간 저속 영상 실험은 축 (Z) 차원에서 50 μm의 총 깊이를 스팬 5 광 비행기를 캡처합니다. 형광 T 세포는 일반적으로 10-20 분 동안 10-30초을 이르는 간격으로 몇 군데 있습니다. 공촛점 직립 현미경으로 이미징 T 세포 이 프로토콜에서 사용 공촛점 현미경 20x 물 침지 목표 (올림푸스, 20x/0.95 NA)이 장착된 Leica SP5입니다. <ol start="6"><li> 현미경의 이미징 단계에 슬라이스를 고정합니다. 참고 : 우리는 보통 그것을 고정하기 위해 준비에 세탁기를 놓으십시오. </li><li> Z 축 따라 이미지의 시리즈를 수집하여 이미지 세션을 설정합니다. 손상 조직 구조의 이미지 T 세포하려면 시작 위치는 일반적으로 첫 번째 레이블이 붙은 T 세포 아래의 5-10 μm의에서 설정됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 이 비디오 프로토콜에 따라 당신은 노드의 T ​​존, 정상적으로 생체내 (그림 1)에서이 특정 환경에서 발생하는 현상에 축적 형광 T 세포의 큰 숫자를 시각화하는 기대한다. 특히, T 세포는 단지 캡슐 밑에 일반적으로 B 세포 영역에서 제외되어야합니다. 성공적인 실험은 그대로 림프절 4 얻은 결과를 출판과 일치 높은 운동성이있는 행동 (그림 3)를 표시하는 조직 (그림 2)에 들어갔다 T 세포가 발생합니다. 평균, 조각 내의 개별 T 세포의 평균 속도 가까운 10 μm의 / 분 (그림 4)되어야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. T 세포는 림프절의 슬라이스에 축적. 찬란 - 표시 T 세포는 (CMFDA, 녹색) 이미지 수집하기 전에 림프절 슬라이스 30 분 (위 사진)에 추가되었습니다. 이미지는 Z 방향으로 50 μm의를 스팬 5 이미지의 최대 투영이다. 명시야 이미지는 하단에 표시됩니다. 이미지는 위드의 현미경으로 캡처했다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. T 세포는 림프절의 슬라이스에 들어갔다 있습니다. 찬란 - 표시 T 세포는 (CMFDA, 녹색) 공촛점 현미경을 사용하여 이미지 수집하기 전에 림프절 슬라이스 30 분 추가되었습니다. 이미지가 절단 표면 (상단 사진) 아래 40 μm의 (아래 사진)에서 캡처했습니다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. T 세포는 림프절의 슬라이스 내에 높은 운동성이있는 수 있습니다. 찬란 - 분류 T 세포 위드 현미경을 사용하여 12 분 동안 몇 군데 있었다. 개별 T 세포의 궤도는 파란색 (낮은 운동성이있는 세포) 레드 (높은 운동성이있는 세포)로부터 증가 변위를 나타내는 색으로 트랙으로 표시됩니다. 트랙 Imaris 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 점선 타원은 putative B 세포 영역을 delimits 반면 &#39;화이트 라인은 노드의 가장자리를 따릅니다. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 림프절의 슬라이스 내에 T 세포 속도는 10 μm의 / 분 가까운 거리에 있습니다. 속도는 그림 3에 나타나 트랙에서 Imaris 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.

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	<li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li><li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL21+mediates+CD4++T-cell+costimulation+via+a+DOCK2/Rac-dependent+pathway.">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 도입 T 세포의 동작을 조사하는 데 사용되는 림프절의 조각을 생성하는 간단한, 빠르고 강력한 기술을 설명합니다. 최근에는이 방법이 성공적으로 T 세포의 위치와 운동성 1.5을 제어하는 세포 요소를 식별 thymic 및 림프절의 조각을 사용하여 적용되었습니다. 또한 긍정적인 선택을하는 동안 및 항원 인식 2,6에 따라 T 세포 thymocytes에서 칼슘 2 + 반응을 측정하는 데 사용되었습니다. 오버레이 슬라이스 분석은 장점과 논의가 될 자격 제한을 선물한다. 한 요구가 셀 마이 그 레이션의 분자 제어 방해하기 위해 pharmacologically 조각을 조작하는 경우의,이 시스템은 유용 조직에 액세스할 수 있습니다. 이미징 이후에, 조각이 몇 군데있다 구조에 대한 자세한 정보를 수집 immunohistochemistry에 대해 처리할 수 있습니다. 또한, 관찰은 전통적인 위드의 형광 현미경으로 만들 수 있습니다. 해상도 공촛점 또는 두 광자 현미경으로만큼 좋지 않아 그 phototoxicity은 원칙적으로 두 개의 광자 현미경보다 한 광자 더욱 심각한 있지만, 그것은 단순의 이점, 낮은 비용, 더 큰 선택의 여지가 여기 파장의. 손상 림프절의 T 세포의 이미지가 표시 lymphocytes의 정맥 주사가 필요 림프 기관으로 연속적으로 가정되는. 우리가 이전에 1 보여준 바와 같이, 슬라이스 분석은 입양 전달 실험과 완벽하게 호환됩니다. 그러나, 림프절에 집에 T 세포에 필요한 시간의 길이는 시간이지나면서 세포 밖으로 누설하는 경향을 형광 염료의 사용을 복잡하게하실 수 있습니다. 이것은 칼슘 2 + 염색 fura - 2의 경우입니다. 조직에 T 세포의 빠른 채용 (&lt;30 분)으로 슬라이스 분석은 염료를 사용하는 기회를 제공합니다. 마지막으로,이 방법은 여러 사람이 조직에서 T 세포의 기능을 분석할 수있는 큰 장점 살려두고있다. 이 실험 시스템은 또한 염두에 보관해야합니다 한계를 제공합니다. 깔끔히과 관련된 손상이 특히 상처 표면 근처의 조직의 표면 영역에서 T 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이스 내에서 세포 죽음을 평가하기 위해, 우리는 타협 플라즈마 막과 세포를 관통하는 형광 염료 SYTOX 녹색을 사용했습니다. 우리의 실험은 주로 조직의 표면 지역화된 총 결절 세포의 약 20 %가 찬란이 핵 염색으로 표시라고 밝히지. 분석과 함께 또 다른 잠재적인 우려 chemokines 포함하여 중요한 가용성 요소를 유지하는 조각의 능력입니다. 우리는 T 세포가 슬라이스 내에 좋은 운동성를 표시 이후의 데이터는 이러한 문제에 의해 영향을 받았다고한다는 표시도없고,하지만, 우리는 상처 표면에서 마이크론의 여러 수십에 위치하고 건강한 지역 이미징 T 세포의 중요성을 강조하고 싶습니다. 이것이이 프로토콜에 같은 전통적인 현미경 (위드 필드 또는 공촛점)와 함께 할 수, 반면에, 그것은 림프절 슬라이스 준비가 두 광자 영상은 깊이에 공간적 해상도를 향상시키고 phototoxicity을 줄일 수와 결합 가능성이 높습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> 파인 집게 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,142 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm 문화 삽입 </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> 완전한 RPMI - 매체 10% 열 inactivated 소태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가하여 만든 </td></tr><tr><td> 행크스 &#39;밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 입력 VII - A </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> 부틸 Cyanoacrylate 접착제, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 와셔, 내부 직경 4mm </td><td> DIY 매장 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 셀 트래커 그린 CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging of t cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes

드문 표현 항원을 감지 주변 림프절을 포함하여 이차 림프​​ 기관에 나이브 T 세포는 지속적으로 트래픽이. 림프절에 T 세포의 마이 그 레이션 chemokines 포함한 세포 화학 두 요소를 포함 복잡한 과정이다. 최근 두 광자 현미경의 사용은 그대로 림프절의 T 세포를 추적하고 다른 세포들과 그들의 행동과 상호 작용을 몇 가지 양적 정보를 추출하는 것은 허용하고 있습니다. 생체내 시스템에 명백한 이점이 있지만,이 방법은 복잡하고 비싼 장비가 필요하며 조직에 제한적으로 액세스할 수 있습니다. murine 림프절 내에서 T 세포의 동작을 분석하기 위해, 우리는 슬라이스 분석 1, 원래 neurobiologists로 설정하고 murine thymus 2 최근 바뀜을 개발했습니다. 이 기법에서는 찬란 라벨이 T 세포는 심하게 준비 림프절 슬라이스 위에 도금입니다. 이 비디오 문서에서는 조직에 T 세포의 현지화 및 마이 그 레이션은 위드 필드와 공촛점 현미경으로 실시간으로 분석됩니다. 생체내에서 두 광자 현미경은 그들의 자연 환경에서 이미지를 T 세포에 대한 효과적인 접근 방식을 제공하며, T 세포의 마이 그 레이션을 기본 메커니즘을 명료하게하다 보완하는 기술.

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Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

이 프로토콜은 림프절의 조각에 소개 이미지 형광 T 세포 수있는 방법을 설명합니다. 이 기술은 전통적인 위드 형광 또는 공촛점 현미경과 T 세포의 마이 그 레이션의 실시간 분석을 수 있습니다.

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