Name: optimized pcr-based detection of mycoplasma
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

بتمويل من سيغما الدريخ

1. ميكوبلازما كشفها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن اختبار supernatants ثقافة الخلية مباشرة أو نموذج يمكن إعدادها للاستخدام في وقت لاحق. للتحضير لاستخدامها لاحقا مكان 100 ميكرولتر من طاف في أنبوب التضخيم معقمة واحتضان درجة مئوية لمدة 5 دقائق. في 95 بمجرد اكتمال هذه يمكن تخزينها في العينة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. فقط قبل إلى تشغيل أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة العينة (5 ثوان) لتكوير اي حطام الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير عينات لPCR ، وتحديد الحجم الكلي للطق في Jumpstart العازلة بوليميريز / الإماهة الحمض النووي المطلوبة لردود الفعل. سنكون إعداد 5 ردود الفعل الكلي. وسوف تتطلب ردود فعل 2.5μl خمسة من طق و114.5μl العازلة من الجفاف. هذا وسوف تحتوي على الحد الأدنى من وحدة واحدة من طق في رد الفعل و22.5μl العازلة من الجفاف في رد الفعل السلبي والتحكم العينة زائد 24.5μl من الإماهة العازلة لمراقبة إيجابية. وينبغي أن يضاف 1 وحدة من بوليميريز الحمض النووي في رد فعل على حجم مناسب لتعويض السوائل العازلة. وهذا يختلف مع طق المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان حجم المحسوبة بوليميريز الحمض النووي في أنبوب طق microcentrifuge نظيفة واتبع مع حجم المحسوبة العازلة الإماهة. وينبغي أن تكون مختلطة الحمض النووي بوليميريز / الإماهة العازلة بلطف عبها الأنبوب. لا ينبغي أن يكون هذا الخليط vortexed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير عينات الرقابة السلبية واستخدام أنابيب شفافة المنصوص عليها في رد فعل عدة. الأنابيب تفاعل المنصوص عليها في عدة تحتوي بالفعل nuclueotides والشعائل والداخلية DNA السيطرة. يجب وضع 23 ميكرولتر من مزيج Jumpstart من الحمض النووي طق العازلة البلمرة / الإمهاء ، الذي أعد في الخطوات السابقة ، في كل من السيطرة السلبية وأنابيب العينات. إضافة 2 ميكرولتر من المياه مجانا الحمض النووي لرقابة السلبية وإضافة 2 ميكرولتر من العينة إلى كل من أنابيب العينات والتسمية. خلط محتويات عبها بواسطة الأنابيب. لا ينبغي أن تكون محتويات vortexed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد مراقبة إيجابية استخدام أنابيب رد فعل الوردي المقدمة في المجموعة. الأنابيب تفاعل المنصوص عليها في عدة تحتوي بالفعل nuclueotides والشعائل والداخلية DNA السيطرة. إضافة 25 ميكرولتر من مزيج Jumpstart من الحمض النووي بوليميريز طق العازلة / الإمهاء ، الذي أعد في الخطوات السابقة ، للأنابيب التفاعل والتسمية. خلط محتويات عبها بواسطة الأنابيب. لا ينبغي أن تكون محتويات vortexed. احتضان سيطرة سلبية ، والسيطرة الإيجابية وأنابيب العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لPCR أن تجرى على العينات يجب أن توضع في cycler الحرارية. عند استخدام برنامج Jumpstart طق غير مطلوب خطوة التنشيط. وضع أنابيب رد الفعل في cycler الحرارية. يجب تعيين دورات على النحو التالي : 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية. وسيتم تشغيل هذه الدورات 40 مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب مرة واحدة في دورات PCR تكون قد أكملت تبريد عينات الى 4-8 درجة مئوية بحلول حرمانهم من cycler الحراري ووضعها في الجليد. وينبغي عند عينات فترت يكون تحميلها agarose هلام للالكهربائي. تحميل الجل وصبغ ليست ضرورية لأنها موجودة بالفعل في أنابيب التفاعل. 8 تحميل مباشرة لكل ميكرولتر PCR في ممر منفصل. وقف الكهربائي بعد هجرة 2،5-3،0 سم. </li></ol> 2. ممثل النتائج ينبغي للسيطرة سلبية تظهر الفرقة في حوالي 481 سنة مضت. ويمكن ملاحظة ذلك في العمود تحكم سلبي على هلام الكهربائي الذي يظهر في بداية الفيديو. غياب الرقابة السلبية في الفرقة 481 سنة مضت ، هي مؤشر جيد على أن نشاط بوليميريز لم sufficienttaq المستخدمة لم تكن حساسة بما فيه الكفاية. سوف تظهر عينات إيجابية ميكوبلازما العصابات في مجموعة من 270 ± 8 الغليان. وسوف يكون ثقيلا الفرقة لعينات ملوثة للغاية وخافت لعينات ملوثة طفيفة. ويمكن النظر إلى الاختلافات في كثافة في الأعمدة نموذج ايجابي على هلام الكهربائي الذي يظهر في بداية الفيديو. جميع العينات تحتوي على الرقابة الداخلية السلبية لإثبات أن PCR حدث كما هو متوقع. فمن الطبيعي أن نرى غياب الرقابة الداخلية على عينات ملوثة للغاية. إذا لم يكن هناك عصابة في النطاق الإيجابي أو الفرقة في النطاق السلبي على عينتك هذا يعد مؤشرا جيدا أن تحول دون العينات الخاصة بك. يمكن إذا ما يحول دون تكون العينة إزالة مثبطات PCR عن طريق إجراء استخراج الحمض النووي. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" /> وتظهر نتائج الكشف عن ميكوبلازما بواسطة PCR : الشكل 1 Amplicon العصابات ذات الصلة. 2 لين هو السيطرة السلبية ، التي ينبغي أن تظهر الفرقة في حوالي 481 سنة مضت. غياب الرقابة السلبية في الفرقة 481 سنة مضت ، هي مؤشر جيد على أن تستخدم طق لم تكن حساسة بما فيه الكفاية. سوف ميكوبلازما عينات إيجابية تظهر عصابات في نطاق 270 + 8 الغليان كما هو مبين في الممرات 3-6. وسوف تكون الفرقة هيئة التعليم العاليVY لعينات ملوثة للغاية (حارة 6) ، وخافت لعينات ملوثة طفيفة (حارة 4). جميع العينات تحتوي على الرقابة الداخلية السلبية (481 بي بي) لإثبات أن PCR حدث كما هو متوقع. فمن الطبيعي أن نرى غياب الرقابة الداخلية على عينات ملوثة للغاية.

<ol>
	<li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR)+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines.">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li><li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+(NAT).">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li><li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics:+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques.">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li></ol>

المؤلفون هم موظفون من سيغما الدريخ التي أنتجت الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

وبسبب الحساسية المفرطة من المجموعة ، وعندما يقوم بشكل صحيح يجب أن تسفر عن نتائج محددة عدة تشير إلى أم لا فقد عينتك ميكوبلازما التلوث. وقد الأمثل للاستخدام مع طقم البلمرة Jumpstart من الحمض النووي طق. ويمكن استخدام taqs الأخرى عند إعداد العينات ولكن الرقابة الداخلية في الفرقة 481 الغليان يجب أن تكون موجودة تشير إلى حساسية السليم للطق البديلة. فمن الممكن لنطاقات ايجابية لمعرض كثافات مختلفة تبعا لمستوى التلوث. فمن الممكن أن نلاحظ غياب الفرقة الرقابة الداخلية على عينات ملوثة بشدة. الحذر واستخدام الأسلوب السليم عند إعداد عينات لمنع التلوث وحاسمة لالمناسبة. كشف عند استخدام الكشف بالمرصاد PCR المفطورة كيت.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> بالمرصاد كشف PCR المفطورة كيت </td><td> سيغما الدريخ </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> Jumpstart من البلمرة طق الحمض النووي </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> GenElute الحمض النووي الجينوم الدم طقم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> أنابيب التضخيم نونك </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

optimized pcr-based detection of mycoplasma

صيانة خطوط الخلية خالية من التلوث أمر أساسي لخلية القاعدة البحثية. من بين المخاوف أكبر ملوث وتلوث ميكوبلازما. تباطأ انتشار الأسلحة النووية وعلى الرغم من الانحرافات الكروموسومية ميكوبلازما لا تقتل الخلايا الملوثة عادة ، هم من الصعب كشف ويمكن أن تسبب مجموعة متنوعة من الآثار على الخلايا المستزرعة ، بما في ذلك عملية الأيض تتغير. باختصار ، وتلوث ميكوبلازما التنازلات قيمة هذه خطوط الخلايا في توفير البيانات الدقيقة للبحوث علوم الحياة. مصادر التلوث الميكوبلازما في المختبر هي صعبة للغاية للسيطرة تماما. كما تم العثور على أنواع معينة ميكوبلازما على جلد الإنسان ، ويمكن من خلال تقنية تعرفوا العقيم الفقراء. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها يمكن أن تأتي من مكملات الملوثة مثل مصل بقري جنيني ، والأهم من غيرها من الثقافات الخلية الملوثة. مرة واحدة ميكوبلازما يلوث ثقافة ، فإنه يمكن أن تنتشر بسرعة لتلويث مناطق أخرى من المختبر. الالتزام الصارم الممارسات المختبرية الجيدة ، مثل تقنية العقيم الجيدة هي المفتاح ، وينصح بشدة الفحص الروتيني للميكوبلازما للنجاح في مراقبة التلوث ميكوبلازما. أصبح PCR المستندة الكشف عن الميكوبلازما وسيلة شعبية جدا لصيانة روتينية خلية الخط. طرق الكشف PCR المستندة حساسة للغاية ويمكن أن تقدم نتائج سريعة ، والذي يسمح للباحثين على الاستجابة بسرعة للقضاء على التلوث وعزل حال اكتشافه بالمقارنة مع الوقت المطلوب باستخدام التقنيات الميكروبيولوجية. الكشف عن بالمرصاد PCR المفطورة كيت حساس للغاية ، مع حد الكشف عن الجينوم سوى 2 في ميكرولتر. الاستفادة من البلمرة Jumpstart من الحمض النووي طق محددة للغاية والتصميم التمهيدي الملكية ، وتقلص إلى حد كبير ايجابيات كاذبة. ومريحة 8 أنبوب تنسيق ، والشرائط قبل المغلفة مع dNTPs والاشعال المرتبطة يساعد على زيادة الإنتاجية لتلبية احتياجات العملاء بشكل اكبر مع مجموعات من خطوط الخلايا. نظرا للحساسية البالغة للمجموعة ، يجب توخي الحذر الشديد لمنع التلوث غير المتعمدة من العينات والكواشف. البروتوكول خطوة بخطوة نظهر يسلط الضوء على الممارسات والاحتياطات اللازمة للكشف عن ميكوبلازما موثوق بها. نحن أيضا إظهار ومناقشة نتائج نموذجية وتفسيرها. هدفنا هو التأكد من نجاح الباحثين باستخدام الكشف بالمرصاد PCR المفطورة كيت.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

الكشف عن بالمرصاد PCR المفطورة كيت يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، التي أنشئت بوصفها الأسلوب المفضل لأعلى حساسية في الكشف عن التلوث المفطورة ، Acholeplasma والميورة في الثقافات الأخرى وخلية خلية ثقافة تستمد البيولوجية.

PCR الأمثل القائم على الكشف عن المفطورة

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

الفحص الأمثل الفايبرين الخرزة جل لدراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Detection of Protein Ubiquitination

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

بروتوكول الأمثل لتربية Fopius arisanus ، وهو الطفيل من الفاكهة Tephritid الذباب

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

قياس مرونة للصحفيين طرحه باستخدام لوسيفراس طولية الآلي التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

غرس اليكتروسبون ترقيع الأوعية الدموية مع الهيكل الأمثل في نموذج الفئران

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...