Name: optimized pcr-based detection of mycoplasma
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

הממומן על ידי סיגמא אולדריץ

1. Mycoplasma איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות supernatants סלולרי ניתן לבדוק באופן ישיר או המדגם יכול מוכן לשימוש במועד מאוחר יותר. כדי להכין לשימוש מאוחר יותר במקום 100 μl של supernatant בתוך שפופרת הגברה דגירה סטרילית על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ברגע זה הוא להשלים את המדגם ניתן לאחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע. רק לפני הפעלת צנטריפוגות מדגם בקצרה (5 שניות) על גלולה כל פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את דגימות ה-PCR, לקבוע את הנפח הכולל של המאגר Jumpstart תקי DNA פולימראז / התייבשות הדרושים התגובות. אנחנו נהיה הכנת 5 תגובות מוחלטת. חמש תגובות ידרוש 2.5μl של תקי ו 114.5μl של חיץ להחזרת נוזלים. זה יכיל לפחות יחידה אחת של תקי לכל התגובה 22.5μl של חיץ התייבשות לכל תגובה מדגם שליטה שלילי בתוספת 24.5μl של חיץ התייבשות לשליטה חיובית. 1 יחידה של פולימראז ה-DNA לכל תגובה יש להוסיף נפח מתאים של חיץ להחזרת נוזלים. זה ישתנה עם תקי בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את נפח מחושב של פולימראז הדנ&quot;א תקי לתוך צינור microcentrifuge נקי ופעל עם נפח המחושב של חיץ להחזרת נוזלים. המאגר פולימראז / התייבשות DNA צריכה להיות מעורבת על ידי מצליף בעדינות את הצינורית. תערובת זו לא צריכה להיות vortexed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הביקורת השלילית דגימות להשתמש צינורות התגובה שקוף המסופק בערכה. צינורות התגובה המסופק בערכה כבר מכילים את nuclueotides, primers ו-DNA הבקרה הפנימית. 23 μl של Jumpstart לערבב תקי פולימראז / Rehydration למאגר הדנ&quot;א, מוכן כמו בשלבים הקודמים, צריך להיות ממוקם בכל אחד לשלוט שלילי דוגמיות. הוסף 2 μl מים DNA חופשיים לשלוט שלילי ולהוסיף 2 μl של המדגם לכל אחד הצינורות מדגם התווית. מערבבים את תכולת מצליף על ידי צינורות. תוכן לא צריכה להיות vortexed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את השליטה חיובי להשתמש צינורות התגובה ורוד המסופק בערכה. צינורות התגובה המסופק בערכה כבר מכילים את nuclueotides, primers ו-DNA הבקרה הפנימית. הוסף 25 μl של Jumpstart לערבב תקי פולימראז / Rehydration DNA חיץ, מוכן כמו בשלבים הקודמים, את צינורות התגובה התווית. מערבבים את תכולת מצליף על ידי צינורות. תוכן לא צריכה להיות vortexed. דגירה שליטה שלילית, שליטה חיובית דוגמיות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור PCR כדי לקחת את המקום דגימות את הצורך להציב Cycler תרמית. בעת שימוש JumpStart תקי צעד הפעלה אינה נדרשת. מניחים את צינורות התגובה Cycler התרמית. מחזורי צריך להיות מוגדר כדלקמן: 94 ° C למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות. מחזורים אלה ינוהלו 40 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מחזורי PCR השלימו דוגמאות צריך להיות מקורר 4-8 מעלות צלזיוס על ידי הוצאתם Cycler תרמי הכנסתם קרח. כאשר הדגימות התקררו הם צריכים להיות הועמסו על הג&#39;ל agarose עבור אלקטרופורזה. ג&#39;ל טוען וצבע אינם נחוצים כפי שהם כבר נוכח צינורות התגובה. ישירות לטעון 8 μl לכל PCR למסלול נפרד. עצור את אלקטרופורזה לאחר ההגירה של 2.5-3.0 ס&quot;מ. </li></ol> 2. נציג תוצאות השליטה שלילי צריך להראות להקה של כ 481 נ&quot;ב. ניתן לראות זאת בעמודה בקרה שלילית על ג&#39;ל אלקטרופורזה, אשר מוצג בתחילת הסרטון. היעדרם של הלהקה בקרה שלילית על 481 נ&quot;ב הוא אינדיקטור טוב כי פעילות של פולימראז לא היה בשימוש sufficienttaq לא היה רגיש מספיק. דגימות חיוביות Mycoplasma יציג להקות בטווח של 270 ± 8 נ&quot;ב. הלהקה יהיה כבד על דגימות מזוהמות מאוד חלש עבור דגימות מזוהמות קלות. וריאציות בעוצמת ניתן לראות את העמודות מדגם חיובית על ג&#39;ל אלקטרופורזה, אשר מוצג בתחילת הסרטון. כל הדגימות מכילות פקד שלילי פנימי על מנת להוכיח כי PCR התרחש כצפוי. זה נורמלי לראות את היעדר הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות מאוד. אם אין להקה בטווח חיובי או להקה בטווח שלילית על מדגם שלך זה הוא אינדיקטור טוב כי דגימות שלך עכבות. אם המדגם הוא עכבות מעכבי PCR ניתן להסיר על ידי ביצוע מיצוי DNA. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" /> . איור 1 להקות Amplicon רלוונטיים: תוצאות של גילוי mycoplasma על ידי PCR מוצגים. ליין 2 הוא שליטה שלילי, שאמורה להראות להקה של כ 481 נ&quot;ב. היעדרם של הלהקה בקרה שלילית על 481 נ&quot;ב הוא אינדיקטור טוב כי השתמשו תקי לא היה רגיש מספיק. Mycoplasma חיובי דגימות יציג להקות בטווח של 270 + 8 נ&quot;ב כפי שמוצג נתיבים 3-6. הלהקה יהיה heaVY עבור דגימות מזוהמות ביותר (נתיב 6), קלוש עבור דגימות מזוהמות קלות (מסלול 4). כל הדגימות מכילות פקד שלילי פנימי (481 נ&quot;ב) על מנת להוכיח כי PCR התרחש כצפוי. זה נורמלי לראות את היעדר הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות מאוד.

<ol>
	<li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR)+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines.">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li><li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+(NAT).">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li><li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics:+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques.">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li></ol>

הכותבים הם עובדי סיגמא אולדריץ שיצרה ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

בגלל הרגישות הקיצונית של הערכה, כאשר היא מבוצעת כהלכה הערכה צריכה להניב תוצאות מדויקות המציין אם המדגם שלך יש זיהום mycoplasma. הערכה כבר מותאם לשימוש עם ה-DNA פולימראז תקי JumpStart. Taqs אחרים ניתן להשתמש בעת הכנת הדגימות אבל הלהקה הבקרה הפנימית על 481 נ&quot;ב צריכים להיות נוכחים כדי לציין רגישות ראויה של תקי חלופיים. זה אפשרי עבור הלהקות חיובי להציג צפיפויות שונות בהתאם לרמת הזיהום. אפשר לראות את העדרו של הלהקה הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות בכבדות. באמצעות טכניקה נכונה זהירות בעת הכנת הדגימות על מנת למנוע זיהום הם קריטיים עבור הנכונה. זיהוי בעת שימוש Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> מצפור Mycoplasma PCR ערכת זיהוי </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStart תקי פולימראז ה-DNA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> דם GenElute הגנום דנ&quot;א ערכת </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> הגברה צינורות Nunc </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

optimized pcr-based detection of mycoplasma

תחזוקה של זיהום ללא שורות תאים חיוני מחקר מבוססי תאים. בין החששות הגדולים ביותר הם זיהום זיהום mycoplasma. למרות mycoplasma בדרך כלל לא להרוג תאים נגועים, הם קשים לאיתור יכול לגרום למגוון של השפעות על תאים בתרבית, כולל חילוף החומרים משתנה, האט התפשטות סטיות כרומוזומליות. בקיצור, זיהום mycoplasma פשרות את הערך של שורות תאים אלה במתן נתונים מדויקים על המחקר במדעי החיים. מקורות זיהום mycoplasma במעבדה הם מאוד מאתגר לשלוט לחלוטין. כמו מינים מסוימים mycoplasma נמצאים על העור האנושי, הם יכולים להיות הציג באמצעות טכניקה aseptic עניים. בנוסף, הם יכולים לבוא תוספי מזון מזוהם כמו בסרום שור עוברית, והכי חשוב משאר תרביות תאים נגועים. לאחר mycoplasma מזהם תרבות, היא יכולה להתפשט במהירות לזהם באזורים אחרים במעבדה. ההקפדה על נהלי מעבדה טובים כמו טכניקה aseptic טובים מפתח, בדיקה שגרתית עבור mycoplasma מומלץ מאוד לשליטה מוצלחת של זיהום mycoplasma. PCR מבוססי זיהוי של mycoplasma הפכה שיטה פופולרית מאוד לצורך תחזוקה שגרתית בתא קו. PCR מבוססות שיטות הזיהוי רגישים מאוד והוא יכול לספק תוצאות מהירות, המאפשר לחוקרים כדי להגיב במהירות כדי לבודד ולמנוע זיהום לאחר שהוא זוהה לעומת הזמן הנדרש באמצעות טכניקות מיקרוביולוגיות. Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי רגיש ביותר, עם הגבלה זיהוי של רק 2 הגנום לכל μl. ניצול של פולימראז מאוד ספציפיות תקי DNA JumpStart ועיצוב פריימר קניינית, חיוביות שגויות מופחתים מאוד. הפורמט נוח 8-צינור, רצועות מראש מצופה dNTPs, הקשורים primers עוזר להגדיל את התפוקה כדי לענות על הצרכים של הלקוחות עם אוספים גדולים של שורות תאים. לאור רגישות קיצונית של הערכה, בזהירות רבה יש לנקוט על מנת למנוע זיהום מכוונת של דגימות ריאגנטים. פרוטוקול צעד אחר צעד אנחנו מדגימים מדגיש את אמצעי הזהירות והנהלים הנדרשים לאיתור mycoplasma אמין. אנחנו גם מראים ולדון בתוצאות טיפוסי הפרשנות שלהם. המטרה שלנו היא להבטיח את הצלחת החוקרים באמצעות Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי מנצל את שרשרת התגובה פולימראז (PCR), אשר הוקמה כשיטת הבחירה של רגישות גבוהה לגילוי של זיהום Mycoplasma, Acholeplasma ו Ureaplasma בתרביות תאים והתרבות תאים אחרים הנגזרים ביולוגיות.

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Detection of Protein Ubiquitination

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

פרוטוקול אופטימליים לגידול Fopius arisanus, טפיל של פירות Tephritid זבובים

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

השרשה שתלי כלי הדם Electrospun עם אופטימיזציה מבנה במודל חולדה

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...